如何利用dilution plate的方法分选单克隆细胞
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发布时间：2022-04-26 08:40
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时间：2022-06-25 23:01
预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的细胞培养液，0.1ml/孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml/孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。
3.方法3。我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单克隆。但需注意的是：时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了
培养液：最好是含15％的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。
4.方法4。我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul*在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个克隆，我做过几次了效果很好，没有出现污染。（在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。
