病毒鉴定常用方法有哪些
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发布时间：2022-04-21 23:22
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时间：2024-02-04 13:22
寨卡病毒病的检测方法包括病毒核酸检测、IgM抗体检测、中和抗体检测和病毒分离等。寨卡病毒与黄病毒属其他病毒具有较强的血清学交叉反应，目前主要采用病毒核酸检测。
开展蚊媒寨卡病毒检测时，对捕获的伊蚊成蚊或幼虫进行病毒核酸检测。
开展寨卡病毒实验室检测时，应同时考虑登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒实验室检测应按照相应的技术指南开展。
（一）临床标本检测。
1．病原学检测
病原学检测主要适用于急性期血液标本，一般认为发病7天内检测阳性率高。
（1）核酸检测：采用荧光定量RT-PCR方法，是目前早期诊断寨卡病毒病的主要检测手段。
（2）病毒分离：将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测核酸的方法鉴定病毒。也可使用乳鼠脑内接种进行病毒分离。
2．血清学检测
（1）血清特异性IgM抗体：发病3天后可检出病毒特异性IgM抗体，但发病7天后检出率高。可采用ELISA、免疫荧光等方法检测。IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗体与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等黄病毒有较强的交叉反应，易于产生假阳性。
（2）中和抗体：采用空斑减少中和试验方法检测。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙脑等其他常见黄病毒感染，可以确诊。
（二）媒介标本检测。
1．标本处理
将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点，每10～20只为一份进行研磨处理。
2．病毒核酸检测
用RT-PCR的方法进行寨卡病毒核酸检测
3．病毒分离
病毒核酸阳性的标本进行病毒分离。
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时间：2024-02-04 13:23
病毒鉴定常用方法：
材料与设备
细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等
成斑培养基：含2%FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM
宿主细胞
PBS磷酸缓冲液
琼脂糖，超纯
空斑染色材料（MTT或中性红）
细胞培养级无菌超纯水
移液*头(10 到100 微升)
6孔细胞培养板
离心管
水浴箱
微波炉
倒置显微镜
生物安全柜（超净台）
二氧化碳培养箱
实验方案
细胞接种：每孔按1 x 106细胞每毫升培养基接种细胞至6-孔板里。轻轻地前后左右摇晃培养板使细胞分布均匀。将细胞置培养箱生长过夜。第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。
制备琼脂糖：用水配制2%的琼脂糖，高压灭菌并使之溶化，然后将琼脂糖置于42°C水浴中使之保持在熔解状态。将细胞培养基预热至37°C。（1h后确认琼脂糖温度是否处于42°C，观察其是否仍处于溶解状态但又不至于烫手）。
准备病毒梯度稀释液：标记6个无菌离心管，用于制备病毒稀释液。在第1管内加入990μl，剩下5管分别加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10μl病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100μl加入第2管，依次类推，进行10倍梯度稀释。管2至管6的稀释度分别为 10-3 到 10-7。
感染细胞单层：用无菌吸管吸去6孔板中的培养液，每孔加入100 μl上述稀释好的10-3 到 10-7 的病毒液，留一个孔不加作为空白对照。每板按同样的方法操作。室温放置1h让病毒进入宿主细胞。
覆盖琼脂糖：1h后，小心吸去病毒液，避免碰到细胞。将2%的琼脂糖和预热的培养基按1:1的比例混匀后加轻轻地加1.5mL至每孔细胞上，室温静置20min使其冷却凝固成覆盖层。将培养板置室温或 27°C 培养 6-10 日。
空斑观察和计数：用光从45度角照射培养板，或者可以将培养板倒置在一个黑色背景上，计数空斑数量。为了更易于观察，也可以每孔加入1mL 0.03%的中性红（用水或PBS稀释），室温或27°C 孵育2-3h，未被病毒感染的细胞会被中性红染上而中间未被着色的小区域即为空斑（直径约为0.5-3mm）。计数每孔的空斑数量并按以下方法计算病毒滴度：病毒滴度（pfu/ml）=空斑数×(1 ml / 0.1 ml)/稀释倍数。
