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大肠杆菌转化实验(热击法)

2020-06-13 来源:华佗健康网
大肠杆菌转化实验(热击法)之杨若古兰创作

大肠杆菌转化可以:(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞后果;(3)用于分子生物学其他研讨. 1道理:

质粒DNA粘附在细菌细胞概况,经过42°C短时间的热击处理,促进接收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长. 2器材:

漩涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱. 3材料和试剂:

质粒DNA,重组DNA,培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal. 4实验筹办:

无菌ddH2O,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入响应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配). 5操纵步调:

(1)事先将恒温水浴的温度调到42℃.

(2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后拔出冰上,冰浴5~10min.

(3) 加入10μl连接产品(普通是全部连接产品)(DNA含量不超出100ng),轻轻震动后放置冰上20min.

(4) 轻轻摇匀后拔出42℃水浴中90秒进行热休克,然后敏捷放回冰中,静置3~5min.

(5) 在超净工作台中向上述各管平分别加入900μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震动30min到50min

(6) 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(留意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂).

(7) 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀.

(8) 在涂好的培养皿上做上标识表记标帜,先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到概况的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜.

(9) 在被细菌净化的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验陈述.

(10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好.留意白色菌斑.

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