和抗氧化指标的影响
江红霞;林雄平;轩文娟
【摘 要】Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae, Order Volvocales), a freshwater green microalgal species, has commercial value owing to its ability to accumulate high concentrations of astaxanthin (up to 5% of dry weight). Astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β, β-carotene-4,4′-dione) is a red ketocarotenoid which has many important biologi-cal functions, including antioxidant activity, regulation of immune responses, and disease resistance, and has the potential for application in the aquacultural, nutraceutical, pharmaceutical, and cosmetic industries. H. pluvialis has a distinctive lifecycle as it exhibits a green motile stage and a red non-motile resting stage called an aplano-spore. In general, astaxanthin accumulation in H. pluvialis is restricted to the aplanospore stage. Astaxanthin is
accumulated in extra-plastidic lipid vesicles as a secondary carotenoid, and it is believed to be synthesized in re-sponse to oxidative stress in the red aplanospore stage under unfavorable environmental conditions such as high light, temperature, and salinity, or low nutrient availability. Several enzymes such as lycopene β-cyclase (Lcy),β-carotenoid hydroxylase (CrtR-B) and β-carotene ketolase (Bkt) are involved in the astaxanthin biosynthesis pathway in H. pluvialis. Lcy catalyzes the formation of β-carotene from lycopene, and CrtR-B and Bkt catalyze further steps leading to astaxanthin synthesis. Changes in expression of the genes encoding
these three enzymes can criti-cally affect the biosynthesis and
accumulation of astaxanthin in H. pluvialis. In addition, various antioxidant en-zymes including superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px) also have important protective effects for combating oxidative stress under unfavourable environmental conditions. We aimed to explore the effect of salt stress on astaxanthin accumulation in H. pluvialis, by examining the mechanism of astaxanthin synthesis and the relationship between the different antioxidant mechanisms in H. pluv-ialis at high salinity. We examined its growth rate; astaxanthin content; Lcy, CrtR-B, and Bkt gene expression lev-els; SOD, CAT, and GSH-Px activities; and malondialdehyde (MDA) content at four salinity levels (0.04 mol/L, 0.08 mol/L, 0.12 mol/L, and 0.16 mol/L) over three timescales (3 days, 6 days, and 9 days). Our results showed that the density of H. pluvialis decreased under increasing salinity over different periods of time, while its mortality rate and aplanospore proportion increased with increasing salt stress concentration by the ninth day of stress. Asta-xanthin content, Lcy, CrtR-B, and Bkt gene expressions increased over time with increasing salinity. SOD, CAT, and GSH-Px activities and MDA content also increased in comparison to H. pluvialis grown at the control level of 0 mol/L NaCl, and significantly increased at the 0.12 mol/L NaCl level (P<0.05).
Astaxanthin content and Lcy, CrtR-B, and Bkt gene expressions were lower during the early and mid-stages of salt stress (e.g., on the third and sixth days of observation), and increased by the ninth day. Meanwhile, SOD, CAT, and GSH-Px activities and MDA content were higher during early and mid-
stage stress, but were lower by the ninth day. These results suggest that salt stress can improve astaxanthin accumulation over time in H. pluvialis at the appropriate level of salt stress, despite its negative effects on growth. Astaxanthin synthesis in H. pluvialis is promoted mainly through an increase in the transcription level of astaxanthin synthesis-related enzyme genes under salt stress, and the antioxidant activities of astaxanthin and antioxidant enzymes complement one other to protect from oxidative damage under salt stress. This study provides a new insight into the astaxanthin synthesis and antioxidant mechanisms in H. pluvialis.%为探讨盐胁迫对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)虾青素合成的影响与机理,以及雨生红球藻各抗氧化机制之间的关系,本研究采用生化和分子生物学方法研究了不同浓度(0.04 mol/L、0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L)和不同时间(3 d、6 d和9 d)的盐(NaCl)胁迫对雨生红球藻生长、虾青素积累、番茄红素 β-环化酶(Lcy)、β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)和 β-胡萝卜素酮化酶(Bkt)基因表达、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量的影响.结果表明,各胁迫时间的雨生红球藻的密度均随着盐胁迫浓度的增加而不断下降,在盐胁迫的第9天,雨生红球藻的死亡率和孢子比例均随着盐胁迫浓度的增加而不断升高;雨生红球藻虾青素含量、Lcy、CrtR-B和Bkt基因表达量均随着盐胁迫浓度和时间的增加而不断提高;雨生红球藻SOD、CAT和GSH-Px活性以及MDA含量在不同浓度和不同时间的盐胁迫下与对照组(0.00 mol/L NaCl)相比均升高,且在不同时间的0.12 mol/L NaCl胁迫下与对照组相比均显著升高(P<0.05);雨生红球藻虾青素含量、Lcy、CrtR-B和Bkt基因表达量在盐胁迫的早期(第3天)和中期(第6天)阶段较低,在盐胁迫的后期(第9天)阶段较高,而SOD、CAT和GSH-Px活性以及MDA含量在盐胁迫的早期和中期阶段较高,在盐
胁迫的后期阶段较低.实验结果说明了适当浓度和时间的盐胁迫能促进雨生红球藻累积虾青素,雨生红球藻在盐胁迫下主要是通过提高虾青素合成相关酶基因的转录水平来促进虾青素的合成,其虾青素和抗氧化酶的抗氧化活性可能互为补充,共同保护雨生红球藻免受盐胁迫的氧化损伤. 【期刊名称】《中国水产科学》 【年(卷),期】2017(024)006 【总页数】12页(P1342-1353)
【关键词】雨生红球藻;盐胁迫;虾青素;Lcy;CrtR-B;Bkt;抗氧化酶;MDA 【作 者】江红霞;林雄平;轩文娟
【作者单位】河南师范大学 水产学院, 河南 新乡 453007;宁德师范学院 生物系, 福建 宁德 352100;河南师范大学 生命科学学院, 河南 新乡 453007 【正文语种】中 文 【中图分类】S96
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属的一种淡水单细胞微藻。该藻在不利的环境条件下能产生大量的虾青素, 含量可高达其干重的5.0% [1]。虾青素(astaxanthin, 3-3ʹ,二羟基-β-β′胡萝卜素-4-4ʹ,二酮)是一种氧化型类胡萝卜素, 是一种近年来进入国际研发领域的高价值的生物活性物质, 它具有极强的抗氧化活性, 被誉为是“超级维生素 E”, 并具有抗癌、增强机体免疫力、着色、安全性高等特点, 因而在食品、保健品、药品、化妆品以及饲料领域都有很好的应用前景[2]。
研究表明, 通过人为的设置高光照、高温、高盐或营养饥饿等胁迫手段, 可以促使
雨生红球藻在恶劣的生存环境下由游动细胞转变为不动孢子, 并大量合成和积累虾青素[3–8]。雨生红球藻中的虾青素的合成是在一系列酶的作用下完成的,其中番茄红素β-环化酶(Lcy)、β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)和 β-胡萝卜素酮化酶(Bkt)是合成过程中的3个重要酶, Lcy 催化番茄红素环化成β-胡萝卜素, CrtR-B和Bkt分别催化β-胡萝卜素的羟基化和酮基化反应, 并最终形成虾青素[9–10], 因而这些酶基因表达量的增加可以有效提高雨生红球藻虾青素的合成效率。另外, 各种胁迫作用在促进雨生红球藻合成虾青素的同时, 还会激发其抗氧化系统释放更多的抗氧化酶来提高它的抗氧化能力。实验表明盐胁迫是诱导雨生红球藻合成虾青素的手段之一[3,11–13], 但盐胁迫对雨生红球藻虾青素合成的关键酶基因表达和抗氧化酶活性的影响的研究尚未见报道。本实验在借鉴前人研究的基础上, 探究了不同浓度的盐胁迫对雨生红球藻生长、虾青素积累、Lcy、CrtR-B和Bkt基因表达、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量的影响, 以期为阐明雨生红球藻高效合成虾青素的条件和机理以及雨生红球藻体内各抗氧化机制之间的关系提供一定的理论基础。
雨生红球藻(FACHB-874)原藻种购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。将处于对数生长期的藻种以适当的浓度转接入 MVA 培养基中静置培养, 培养温度25℃、光强2000 lx、光照周期 12 h : 12 h (光 : 暗)、每天摇动 1～2次。 将培养至对数生长期的雨生红球藻(密度约5×105 cell/mL) 3800 g 离心5 min, 沉淀的藻细胞在250 mL的锥形瓶中重悬于150 mL新鲜的含有不同浓度氯化钠(NaCl)的培养基中, 使接种密度调整为1.5×105 cell/mL, 然后进行盐胁迫实验。胁迫实验设置 1个对照组和4个实验组, 实验组的培养基中分别加入NaCl, 使其终浓度分别为0.04 mol/L、0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L, 对照组中不加NaCl, 盐浓度为0 mol/L, 每组各设3个重复。雨生红球藻的培养周期为9 d, 培养期间每日摇瓶 1～2次, 防止细胞贴壁, 分别在培养的第3天、第6天和第9天检
测藻密度、孢子比例、死亡率、虾青素含量、番茄红素β-环化酶(Lcy)、β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)和 β-胡萝卜素酮化酶(Bkt)基因的相对表达量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量。
用血球计数板进行显微计数测定藻密度。将雨生红球藻培养物充分摇匀后取 5 mL放入试管中, 用 4%戊二醛固定藻样后摇散, 在奥林巴斯BX61双筒显微镜下计数, 藻数目多时, 可稀释后计数, 每个重复计数3次, 取平均值。同时在显微镜下观察藻细胞的形态变化, 计算孢子比例和死亡率。
参照 Boussiba等[14]以及韦韬等[15–16]的方法测定虾青素含量。取20 mL藻液, 3000 r/min离心10 min, 弃上清液。藻沉淀中加入5% KOH和30%甲醇(体积比)破坏叶绿素, 离心收集沉淀。向离心管中加入约 3 mL含有少量醋酸的二甲基亚砜(DMSO), 摇匀, 70℃保温5 min, 保温过程不断摇匀离心管, 然后离心并将上清液移入10 mL容量瓶中。沉渣中再加入DMSO反复抽提多次至藻体发白, 然后高速离心, 收集上清液。红色上清液用二甲基亚砜精确定容后, 放入1 cm光径比色皿中,在492 nm波长下测定吸光度值A492, DMSO做空白对照。虾青素的含量计算公式为:其中, C表示单位体积内的虾青素含量(mg/mL); 消光系数 A492为492 nm处1 cm液层混合物的吸光值。另取20 mL藻液, 离心, 弃上清, 藻沉淀于 80℃烘干至恒重,称重后计算每毫升藻液中雨生红球藻的干重。最后将虾青素含量换算成每克干重所含虾青素的毫克数(mg/g干重)。
基因表达分析采用实时荧光定量 PCR(qRTPCR)法。用primer 5.0软件进行qRT-PCR引物设计, 引物序列见表 1, 引物由南京金斯瑞生物工程公司合成。用 Trizol法提取不同浓度盐胁迫处理的雨生红球藻 RNA, 用逆转录试剂盒 Prime-Script®RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,Dalian, China)进行cDNA第一链的合成。以cDNA为模板, 利用 SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa,Japan)
试剂盒在 CFX96TM实时荧光定量 PCR仪(Bio-Rad, USA)上进行扩增, 反应条件为: 95℃预变性30 s; 95℃ 5 s、60℃ 30 s, 40个循环; 95℃10 s; 熔解曲线: 以0.5℃/s从65℃缓慢增加到95℃。以18S基因为内参, 每个样品设置3个平行。基因的相对表达量采用2–ΔΔCT方法[17]计算。
将藻液以5000 r/min离心10 min, 弃上清, 藻沉淀中加入预冷的 0.05 mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH 7.8), 冰浴条件下超声波破碎藻细胞和孢子,12000 r/min离心10 min, 上清液为粗酶提取液,4℃保存待用。提取液的总蛋白含量根据考马斯亮蓝G-250法[18]进行测定, 标准蛋白为牛血清白蛋白(BAS, 购于BBI公司)。 SOD活性按照氮蓝四唑光化学还原反应法[19]进行测定, 以每毫克蛋白能引起反应初速度半抑制时的酶用量为1个SOD活力单位(U/mg蛋白)。CAT活性采用紫外分光光度法[20]进行测定, 以每毫克蛋白每分钟使A240下降0.01为1个CAT活力单位(U/mg蛋白)。GSH-Px 活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定, 方法参照产品说明书, 以每分钟每毫克蛋白扣除非酶反应作用、使反应体系中 GSH浓度降低 1 μmol/L为1个GSH-Px活力单位(U/mg蛋白)。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[21], 测定原理是基于膜脂过氧化产物 MDA可与硫代巴比妥酸反应生成红色产物, 在532 nm处有最大吸收峰(μmol/mg蛋白)。
实验数据以平均值±标准差(SD)表示, 采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学检验, 利用 SPSS20.0 软件进行数据的统计分析和计算各指标之间的皮尔逊(Pearson)相关系数。统计学显著性水平设定P＜0.05为显著性差异。
不同浓度盐胁迫对雨生红球藻生长的影响见表2。最低浓度盐胁迫组(0.04 mol/L NaCl)的藻密度的变化与对照组(0.00 mol/L NaCl)相似, 随着生长时间的延长, 藻密度迅速增加。而0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组的藻密度增长缓慢, 且第9天时的藻密度与第6天时相比都下降了。各胁迫时间的藻密度均随着盐胁迫浓度的增加而逐渐下降。藻的死亡率均随着盐胁迫浓度的增加和胁迫时
间的延长而逐渐升高。0.04 mol/L NaCl胁迫组和对照组在9天的时间内均未出现不动孢子, 而0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组在第6天和第9天时出现大量的不动孢子, 尤其是0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组的藻细胞在第9天时完全转变成不动孢子。
由图1可知, 在盐胁迫的第3天和第6天, 对照组中均未检测到虾青素, 但雨生红球藻虾青素含量随着盐胁迫浓度的增加而逐渐升高, 在0.16 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于两个低浓度盐胁迫组(0.04 mol/L和 0.08 mol/LNaCl, P＜0.05)。在盐胁迫的第 9天, 雨生红球藻虾青素含量也随着盐胁迫浓度的增加而逐渐升高,在0.16 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于2个低浓度盐胁迫组(0.04 mol/L和0.08 mol/L NaCl)和对照组(P＜0.05)。各浓度盐胁迫组的虾青素含量均在第9天最高, 第6天次之, 第3天最低。
用qRT-PCR的方法测定了盐胁迫下雨生红球藻Lcy、CrtR-B和Bkt基因表达量的变化(图2～图4)。Lcy基因的表达量在盐胁迫的第3天, 0.16 mol/L NaCl胁迫组显著高于对照组(P＜0.05); 在盐胁迫的第6天, 0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组显著高于对照组(P＜0.05); 在盐胁迫的第 9天,0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组显著高于对照组(P＜0.05)。CrtR-B基因的表达量在盐胁迫的第3天、第6天和第9天, 0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组均显著高于对照组(P＜0.05)。Bkt基因的表达量在盐胁迫的第3天, 0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组显著高于对照组(P＜0.05); 在盐胁迫的第6天, 0.04 mol/L、0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组均显著高于对照组(P＜0.05); 在盐胁迫的第 9天,0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组显著高于对照组((P＜0.05)。然而, 不同胁迫时间的雨生红球藻Lcy、CrtR-B和Bkt基因表达水平均随着盐胁迫浓度的增加而逐渐升高, 在 0.16 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于对照组(P＜0.05)。各浓度盐胁迫的雨生红球藻 Lcy、
CrtR-B和Bkt基因表达量均在第9天最高, 第6天次之,第3天最低。
由图5、图7可知, 在盐胁迫的第3天, 雨生红球藻SOD和GSH-Px酶活力均随着盐胁迫浓度的增加而逐渐升高, 在0.16 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于最低浓度盐胁迫组(0.04 mol/L NaCl)和对照组(P＜0.05), 0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组的雨生红球藻SOD和GSH-Px酶活力均无显著差异(P＞0.05)。在盐胁迫的第6天和第9天, SOD和GSH-Px酶活力随着盐胁迫浓度的增加先升高后下降, 在0.12 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于对照组(P＜0.05)。各浓度盐胁迫组的雨生红球藻 SOD酶活力均为在第 6天时最高, 第 3天次之, 第 9天最低, 而GSH-Px酶活力均为在第3天时最高, 第6天次之,第9天最低。雨生红球藻CAT酶活力在盐胁迫下的变化见图 6, 各胁迫时间的雨生红球藻 CAT酶活力均随着盐胁迫浓度的增加先升高后下降, 在0.12 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并均显著高于两个低浓度盐胁迫组(0.04 mol/L和0.08 mol/L NaCl)和对照组(P＜0.05)。各浓度盐胁迫组的雨生红球藻CAT酶活力均为在第6天时最高, 第3天次之, 第9天最低。
由图8可知, 在盐胁迫的第3天, 雨生红球藻MDA含量随着盐胁迫浓度的增加不断升高, 在0.16 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于2个低浓度盐胁迫组(0.04 mol/L和 0.08 mol/L NaCl)和对照组(P＜0.05), 两个高浓度盐胁迫组(0.12 mol/L和 0.16 mol/L NaCl)的雨生红球藻MDA含量无显著差异(P＞0.05)。在盐胁迫的第 6天, 雨生红球藻 MDA含量随着盐胁迫浓度的增加先升高后下降, 在0.12 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于其他各盐浓度胁迫组和对照组(P＜0.05)。在盐胁迫的第9天, 雨生红球藻MDA含量也随着盐胁迫浓度的增加先升高后下降, 在0.08 mol/L NaCl胁迫组达到最大值, 并显著高于对照组(P＜0.05), 0.04 mol/L、0.08 mol/L、0.12 mol/L和0.16 mol/L NaCl胁迫组的雨生红球藻MDA含量均无显著差异(P＞0.05)。各浓度盐胁迫组的雨生红球藻MDA含量均为
在第6天时最高, 第3天次之, 第9天最低。
由表 3可知, 在各个胁迫时间点, 盐胁迫的浓度与藻的生长(藻密度)均呈负相关的关系, 而与虾青素含量以及虾青素合成相关酶基因(Lcy、CrtR-B和Bkt基因)的表达均呈正相关的关系, 同时盐胁迫下藻的生长(藻密度)和虾青素含量以及虾青素合成相关酶基因表达之间均呈负相关的关系, 而虾青素含量和虾青素合成相关酶基因表达之间则呈正相关的关系。另外, 由图1和图5～图7则可以看出, 在盐胁迫的早期(第 3天)和中期(第6天)阶段虾青素含量较低, 而抗氧化酶SOD、CAT和 GSH-Px的活性较高, 而在盐胁迫的晚期(第 9天)阶段虾青素含量较高, 而抗氧化酶的活性较低, 说明在盐胁迫下, 雨生红球藻虾青素的抗氧化活性和抗氧化酶的抗氧化活性之间有一定的此消彼长、互为补充的关系。
研究表明各种环境胁迫都可以直接或间接在生物体内形成活性氧(ROS), 包括超氧阴离子自由基(O2–·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH·)、脂质过氧化物(ROOH)和单线态氧(1O2)等, 过量的ROS会引发细胞大分子的氧化损伤, 从而阻碍生物体的生长和发育[22–24]。盐胁迫也会影响雨生红球藻的生长和发育, 如使雨生红球藻的光合作用下降, 生长减慢, 因而培养基盐度的增加不利于雨生红球藻的生长[3,11,25]。在本研究中, 与对照组相比, 盐胁迫也同样抑制了雨生红球藻的生长,造成了藻密度的下降, 死亡率的升高。这是因为在正常情况下, 藻类同其他植物一样, 细胞内ROS的产生与清除处于动态平衡状态, 然而当受到盐胁迫时, 细胞中产生的ROS会大于被清除的ROS, 从而打破了这种动态平衡, 引发体内氧化胁迫, 甚至引起代谢紊乱, 最终抑制了藻的生长和发育, 甚至造成藻的死亡[26]。
尽管盐胁迫不利于雨生红球藻的生长, 却可以促进藻细胞快速转变为不动孢子和累积虾青素。本研究中, 长期(9 d)的高浓度盐(0.12 mol/L和 0.16 mol/L NaCl)胁迫使藻细胞全部转变为不动孢子, 而对照组仍全部为游动细胞, 这与黄水英等[25]和 Gao等[27]的研究一致。另外, 董庆霖等[3]的研究表明雨生红球藻在添加了0.15
mol/L NaCl的BBM培养基中, 在培养的第4天开始合成虾青素, 第5天时虾青素含量达到0.75 mg/g, 而在基础培养基中的雨生红球藻没有虾青素积累。黄水英等[25]的研究发现在BBM培养基中添加低于10 g/L的 NaCl能诱导雨生红球藻快速积累虾青素。Boussiba等[28]的研究也表明将培养雨生红球藻的BG11培养基中的NaCl浓度提高3倍时, 会促进雨生红球藻大量产生虾青素。Gao等[27]在培养雨生红球藻的BBM培养基中添加了0.17 mol/L NaCl, 经过10 d的培养后发现3种不同藻株的雨生红球藻的虾青素含量都大幅度的提高了。在本实验所设定的小于10 g/L的各浓度盐胁迫下, 雨生红球藻在 9 d的胁迫时间内, 虾青素的含量随着盐胁迫浓度和时间的增加而不断提高, 这一结果进一步证实了适当浓度(＜10 g/L)和时间(＜10 d)的盐胁迫能够诱导雨生红球藻产生虾青素。然而,盐胁迫促使雨生红球藻合成虾青素的分子调控机制目前尚不十分清楚, 盐胁迫过程中虾青素合成相关酶基因表达变化的研究将有助于我们进一步了解盐胁迫使雨生红球藻虾青素含量提高的原因。
许多学者研究了各种逆境胁迫或诱导条件下雨生红球藻虾青素合成途径中相关酶基因表达的变化, 如Steinbrenner等[29]研究发现, 在光照胁迫下, 伴随着雨生红球藻虾青素的积累, 虾青素合成相关酶包括八氢番茄红素合成酶基因(Psy)、八氢番茄红素去饱和酶基因(Pds)、番茄红素β-环化酶基因(Lcy)和 CrtR-B基因的转录水平都大大提高了。Gao等[30]在雨生红球藻的培养基中加入25 mg/L和 50 mg/L的水杨酸(SA), 雨生红球藻Psy、Pds、Lcy、CrtR-B和Bkt的基因的转录水平也大为提高。尚敏敏等[31]的研究表明, 在5 mg/L和 10 mg/L的黄腐酸(FA)的诱导下, 雨生红球藻CrtR-B基因的表达量分别提高了18.1倍和7.3倍。本研究中, 雨生红球藻Lcy、CrtR-B和Bkt基因的表达水平均随着盐胁迫浓度和时间的增加而不断提高, 这与 Steinbrenner等[29]、Gao 等[30]和尚敏敏等[31]的研究结果基本一致。另外, 在本研究中,在盐胁迫的早期(第3天)阶段, Lcy基因的表达量在最高
浓度盐(0.16 mol/L NaCl)胁迫下才显著高于对照组(P＜0.05), 而CrtR-B和Bkt基因的表达量分别在0.08 mol/L和0.12 mol/L NaCl胁迫下与对照组相比已有了显著的升高; 在盐胁迫的中期(第 6天)阶段, Lcy基因的表达量在 0.12 mol/L NaCl胁迫下与对照组相比开始有了显著的升高(P＜0.05), 而 CrtR-B和 Bkt基因的表达量均在0.08 mol/L NaCl胁迫下与对照组相比就开始有了显著的升高(P＜0.05); 在盐胁迫的晚期(第9天)阶段, 这3种基因的表达量均在0.08 mol/L NaCl胁迫下与对照组相比就开始有了显著的升高(P＜0.05)。这一结果说明了当盐胁迫的时间较短时,与β-胡萝卜素的生成有关的Lcy基因对盐胁迫浓度的敏感性低于直接与虾青素的生成有关的CrtR-B和 Bkt基因, 但在长期的盐胁迫下, 这 3种基因对盐胁迫浓度的敏感性是一致的。梁成伟等[32]分别用脱落酸(ABA)和氮饥饿加高光诱导雨生红球藻一段时间后, Psy、Pds、CrtR-B和 Bkt基因的 mRNA水平均会明显的升高, 而 Lcy mRNA水平则一直变化不大。这也说明了Lcy基因对外界诱导条件的敏感性较低。梁成伟等[32]认为 Lcy基因是组成型的基因, 因而不受这些诱导条件的调控。但本研究以及 Steinbrenner等[29]和Gao等[6,30]的研究却表明在一定时间和剂量的环境胁迫或诱导条件下, Lcy基因的表达水平是会显著提高的。这说明Lcy基因并非组成型的基因, 梁成伟等[32]的研究结果可能与胁迫或诱导的物质本身的性质有关, 其次也可能和胁迫或诱导的剂量或时间不足有关。此外, 本研究中盐胁迫所导致的雨生红球藻虾青素合成相关酶基因的表达变化与虾青素含量的变化基本是一致的, 二者呈正相关的关系, 这说明在盐胁迫下雨生红球藻中过量产生的 ROS有可能作为一种分子信号启动了虾青素合成相关酶基因的转录, 雨生红球藻通过提高这些酶基因的转录水平, 并提高这些酶蛋白的产量从而来促进虾青素的合成。然而, 这一结论还需要从蛋白水平的研究上进一步加以确认。
研究认为, 在环境胁迫下, 雨生红球藻细胞中的β-胡萝卜素由叶绿体转运到细胞质中合成虾青素[33−34], 而虾青素的合成是为了淬灭环境胁迫下藻细胞内过量产生
的ROS[35−36]。例如, Li等[37]的研究认为虾青素的合成是一个过量的氧依赖性的过程, 并在虾青素合成过程中消耗细胞内的分子氧, 从而减少了细胞 ROS的生成; Tjahjono等[38]以及王劲等[39]的研究发现, ROS胁迫能够促进雨生红球藻中虾青素含量的增加; 肖媛等[40]的研究发现, 雨生红球藻中的 R O S含量与虾青素含量存在一定的相关性, 雨生红球藻可能主要利用虾青素来清除由 UV-B辐射诱导产生的ROS。另外, 在环境胁迫条件下, 藻细胞内 ROS的增加还可以上调各种抗氧化酶基因的表达, 而各种抗氧化酶同样起着清除细胞内多余的 ROS,对藻细胞起抗氧化保护的功能[41]。SOD、CAT 和GSH-Px是生物体抗氧化防御体系中最主要 3种抗氧化酶。SOD是抗氧化防御系统的第一道防线,能催化超氧化物自由基(O2–·)与 H+结合, 将 O2–·还原成过氧化氢(H2O2), CAT则催化 H2O2分解为H2O和O2, 而GSH-Px则催化H2O2与还原性谷胱甘肽(GSH)反应生成 H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG), 从而保护机体免受 ROS 的损害[42–44]。本研究中, 各胁迫时间的各浓度盐胁迫组的雨生红球藻 SOD、CAT和 GSH-Px活性与对照组(0.00 mol/L NaCl)相比都提高了, 这说明了盐胁迫不但能提高雨生红球藻虾青素的含量, 另一方面也提高了各种抗氧化酶的活性, 二者可能共同作用来清除细胞内多余的 ROS, 保护雨生红球藻免受氧化损伤。本研究中, 在盐胁迫的第 3天和第6天, 雨生红球藻虾青素含量较低, 但SOD、CAT和 GSH-Px活性则较高, 而在盐胁迫处理的第 9天, 雨生红球藻虾青素大量合成, 但 SOD、CAT和GSH-Px酶活力降至最低。这些结果进一步说明雨生红球藻的虾青素和抗氧化酶的抗氧化作用可能是互为补充、协调作用的, 盐胁迫的早期抗氧化防御机制主要是依靠各种抗氧化酶, 而长期抗氧化防御机制则主要是依靠虾青素, 这一结果与王潮岗等[45]和杨瑾等[4]的研究结果一致,其原因可能是抗氧化酶对环境胁迫的响应时间比较短, 因而在环境胁迫的早期阶段, 雨生红球藻主要依靠各种抗氧化酶来清除多余的 ROS, 而虾青素是一种次级代谢产物, 需要经过一系列的酶促反应才能生成, 因而对胁迫的响应时间较长,在长时间的
环境胁迫下, 藻细胞内蛋白质会被损伤、降解, 各种抗氧化酶活力会下降, 这时雨生红球藻 ROS的清除机制则可能主要依靠大量产生的虾青素[41]。
MDA是自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用而形成的脂质过氧化物,MDA含量越高, 则说明生物膜的氧化损伤程度越大[46]。同时MDA还可与蛋白质的游离氨基作用, 引起蛋白质分子内与分子间的交联, 进一步导致细胞的损伤[47]。本研究中, 各浓度盐胁迫组的雨生红球藻 MDA含量在各处理时间与对照组(0.00 mol/L NaCl)相比都提高了, 这说明盐胁迫所产生的ROS已经造成了生物膜的氧化损伤, 这种氧化损伤必将会进一步造成雨生红球藻的一些代谢和功能的紊乱, 甚至死亡, 这也是盐胁迫造成藻密度下降的一个重要原因。另外, 雨生红球藻MDA含量在盐胁迫的早期(第3天)和中期(第6天)阶段较高, 而在盐胁迫的晚期(第 9天)阶段较低, 这可能是因为在盐胁迫的早期和中期阶段,尽管各种抗氧化酶的活性较高, 但由于虾青素的含量较低, 雨生红球藻的总抗氧化能力尚不足于抵抗大量产生的 ROS, 从而造成了生物膜的脂质过氧化物, 丙二醛含量升高。而在盐胁迫的晚期阶段, 尽管各种抗氧化酶的活性下降, 但这一时期大量产生的虾青素使藻细胞的总抗氧化能力大大增强, 从而降低了 ROS对膜脂的过氧化作用,丙二醛含量也大大降低。由此可见, 尽管在盐胁迫下, 雨生红球藻的虾青素和各种抗氧化酶的抗氧化作用是互为补充, 共同作用的, 但相较而言,虾青素在清除雨生红球藻体内 ROS的抗氧化机制中可能起着更为重要的作用。这一结果也与王潮岗等[45]的研究结果一致。但由于虾青素累积在雨生红球藻细胞质的脂质体内, 而ROS主要由叶绿体和线粒体产生, 二者在空间上是分离的,ROS是否能够跨过生物膜释放到细胞质中, 然后再由虾青素淬灭, 目前还没有直接的实验证明。尽管 Li等[37]的研究仍表明虾青素可能作为中间媒介物质在清除细胞内多余的 ROS中起着重要的作用, 但由于缺乏直接的证据, 以上结论仍需要进一步的研究确认。
盐胁迫抑制了雨生红球藻的生长、促进了虾青素的累积和 Lcy、CrtR-B和 Bkt基
因的表达、以及SOD、CAT和GSH-Px活性和MDA含量的升高。雨生红球藻虾青素含量、Lcy、CrtR-B和Bkt基因表达量在短期盐胁迫下较低, 而在长期盐胁迫下较高。雨生红球藻SOD、CAT和GSH-Px活性以及 MDA含量则在短期盐胁迫下较高, 而在长期盐胁迫下较低。盐胁迫下雨生红球藻主要通过提高虾青素合成相关酶基因的转录水平来促进虾青素的合成。雨生红球藻的抗氧化酶和虾青素的抗氧化防御机制分工合作、互为补充、协调作用, 共同保护雨生红球藻免受环境胁迫条件下的氧化损伤。但虾青素在雨生红球藻体内的抗氧化机制仍需进一步的研究确认。本研究为利用雨生红球藻生产虾青素的盐胁迫条件进行了探讨,同时为人们了解盐胁迫条件下雨生红球藻虾青素的合成机理以及虾青素的合成与几种抗氧化指标的关系提供了基础资料。
We aimed to explore the effect of salt stress on astaxanthin accumulation in H. pluvialis, by examining the mechanism of astaxanthin synthesis and the relationship between the different antioxidant mechanisms in H. pluvialis at high salinity. We examined its growth rate; astaxanthin content; Lcy, CrtR-B, and Bkt gene expression levels; SOD, CAT, and GSH-Px activities; and malondialdehyde (MDA) content at four salinity levels (0.04 mol/L,0.08 mol/L, 0.12 mol/L, and 0.16 mol/L) over three timescales (3 days, 6 days, and 9 days). Our results showed that the density of H. pluvialis decreased under increasing salinity over different periods of time, while its mortality rate and aplanospore proportion increased with increasing salt stress concentration by the ninth day of stress. Astaxanthin content, Lcy, CrtR-B, and Bkt gene expressions increased over time with increasing salinity. SOD, CAT,and GSH-Px activities and MDA content also increased
in comparison to H. pluvialis grown at the control level of 0 mol/L NaCl, and significantly increased at the 0.12 mol/L NaCl level (P＜0.05).
Astaxanthin content and Lcy,CrtR-B, and Bkt gene expressions were lower during the early and mid-stages of salt stress (e.g., on the third and sixth days of observation), and increased by the ninth day. Meanwhile, SOD, CAT, and GSH-Px activities and MDA content were higher during early and mid-stage stress, but were lower by the ninth day. These results suggest that salt stress can improve astaxanthin accumulation over time in H. pluvialis at the appropriate level of salt stress,despite its negative effects on growth. Astaxanthin synthesis in H. pluvialis is promoted mainly through an increase in the transcription level of astaxanthin synthesis-related enzyme genes under salt stress, and the antioxidant activities of astaxanthin and antioxidant enzymes complement one other to protect from oxidative damage under salt stress.This study provides a new insight into the astaxanthin synthesis and antioxidant mechanisms in H. pluvialis. 【相关文献】
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