【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N,N'—亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的蒸馏水中。加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0。45μm孔径)过滤除菌,查证该溶液的pH值应不大于7。0,置棕色瓶中保存于4℃温度。
【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子,在丙烯酰胺贮存液中加入大约0。2体积的单床混合树脂(MB-1Mallinckrodt),搅拌过夜,然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间,丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸,因此大于1年的溶液应该被丢弃。 2.40%丙烯酰胺(用于DNA测序,1L)
【配制方法】把380g丙烯酰胺(DNA测序级)和20g N,N'-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中.继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理,但加热溶解后应以蒸馏水补足
至终体积为1L。置棕色瓶中保存于室温.
【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明,40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。 3.0.1mol/L腺苷三磷酸(ATP)溶液(1ml)
【配制方法】在0.8ml蒸馏水中溶解60mg ATP,用0。1mol/L NaOH调至pH值至7.0,用蒸馏水稀释1ml
【注意】分装成小份保存于—70℃ 4.10mol/L乙酸铵溶液(1L)
【配制方法】把770g乙酸铵溶解于800ml蒸馏水中,加水稀释至1L后过滤除菌.在4°C储存.
【注意】乙酸铵是热不稳定的。不要高压灭菌。 5.10%过硫酸铵溶液(10ml)
【配制方法】把1g过硫酸铵溶于8ml蒸馏水中,用蒸馏水补足体积至10ml。该溶液可在4℃保存数周。
6.1mol/L CaCl2溶液(200ml)
【配制方法】称取54g CaCl2·6H2O并溶解在170ml蒸馏水中,用蒸馏水补足体积至200 ml。用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10ml小份贮存于—20℃.
【用法】制备感受态细胞时,将等分试样解冻,用蒸馏水稀释至100ml。通过Nalgene过滤器(0。45微米)过滤除菌,并在使用前冷却至0℃。 7.2。5mol/L CaCl2溶液(20ml)
【配制方法】称取13.5g CaCl2·6H2O并溶于15ml蒸馏水中,用蒸馏水补足体积至20ml。用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。 8.脱氧核苷三磷酸(dNTPs)溶液
【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右,用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节每一dNTP溶液的pH值7.0(用pH试纸检测),把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释,在给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度。 碱基 A G C T 波长 259 253 271 260 消光系数(ε)(M·cm) 1.54×104 1.37×104 9。10×103 7。40×103 —1—1计算每个dNTP的实际浓度。对于路径长度为1cm的比色皿,吸光度等于消光系数和摩尔浓度的乘积.
然后用蒸馏水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP,分别分装成小份贮存于—70℃。 9.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液(20ml)
【配制方法】称取3。09g DTT,溶于15ml蒸馏水中,用0.01mol/L乙酸钠溶液(pH5。2)补足体积至20ml.通过0。22微米过滤器过滤除菌后分装成1ml小份贮存于—20℃。 【注意】不要对DTT或含有DTT的溶液进行高压灭菌。 10.0。5mol/l EDTA(pH8。0)溶液(1L)
【配制方法】在800ml蒸馏水中加入186.1gNa2EDTA·2H2O,在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调节溶液的pH值至8。0(约需20g NaOH颗粒),然后稀释至1L,分装后高压灭菌备用.在室温下保存。
【注意】EDTA二钠盐不溶于水,需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0,才能完全溶解。
分配适当的等分试样并通过高压灭菌消毒。 11.溴化乙锭(10mg/ml溶液)(100ml)
【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,保存于4°C。
【注意】小心:溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性,使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套,称量染料时要戴面罩。使用后,这些溶液应进行净化。有关如何执行此操作的详细信息,请参阅机构指南。
12.2×HEPES缓冲盐溶液(100ml)
【配制方法】用90ml的蒸馏水溶解1。6g NaCl、0.074g KCl、0。027g Na2PO4·2H2O、0.2g葡萄糖和1gHEPES,用0.5mol/l NaOH调节pH值至7.05,再用蒸馏水稀释至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌,分装成5ml小份,贮存于-20℃。 13.1mol/l异丙硫基—β—D-半乳糖苷IPTG溶液(10ml)
【配制方法】IPTG(分子量为238。3),在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后,用蒸馏水稀释至10ml,用0.22μm一次性滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃. 14.1mol/L乙酸镁(MgOAc)溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解214。46g四水乙酸镁,稀释至1L过滤除菌.在室温下保存。
15.1mol/L MgCl2溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解203。4g MgCl2·6H2O,用水稀释至1L,分装成小份并高压灭菌备用.在室温下保存。
【注意】MgCl2极易潮解,应选购小瓶(如100g)试剂,启用新瓶后勿长期存放. 16.酚/氯仿溶液
【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)萃取几次以平衡这一混合物,置棕色玻璃瓶中,上面覆盖等体积的0。01mol/l Tris·HCl(pH7。6)液层,保存于4℃。 【注意】酚腐蚀性很强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜,穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。
17.10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液(10ml)
【配制方法】用10ml异丙醇溶解PMSF成1.74mg,分装成小份贮存于—20℃.如有必要可配
成浓度高达17.4mg/ml的贮存液(100mmol/L)。
【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险.一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之.凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF的水溶液在其已经变为碱性(pH〉 8.6)并在室温下储存几小时后可以安全地丢弃. (PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快,且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时,20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为35min。) 18.1mol/L乙酸钾(pH7。5)溶液(100ml)
【配制方法】将9。82g乙酸钾溶解于90ml蒸馏水中,用2mol/L乙酸调节pH值至7。5后稀释到100ml,分装成小份后保存于-20℃。 19.3mol/L乙酸钠(pH7。0)溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解408。1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至5.2,稀释到1L,分装后高压灭菌。在室温下保存。 20.3mol/L乙酸钠(pH5。2)溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解408.1g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至7。0,稀释到1L,分装后高压灭菌。在室温下保存。 21.5mol/L NaCl溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解292。2g NaCl加水稀释至1L,分装后高压灭菌。在室温下保存
22.10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(1升)
【配制方法】在900ml蒸馏水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃溶溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水稀释至1L,分装备用.在室温下保存。
【注意】SDS的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS。10%SDS溶液无须灭菌。 23.20×SSC(NaCl和柠檬酸钠)溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解175。3g NaCl和88。2g柠檬酸钠,加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7。0,加水稀释至1L,分装后高压灭菌。在室温下保存。 24.20×SSPE溶液(盐,磷酸钠,EDTA)(1升)
【配制方法】在800ml毫升水中溶解175.3g NaCl,31.2g NaH2PO4·2H2O和7。4g EDTA,用NaOH溶液调节pH值至7。4(约需6。5ml 10ml/L NaOH),加水稀释至1L,分装后高压
灭菌。在室温下保存。
25.100%三氯乙酸(TCA)溶液(500g TCA)
【配制方法】在装有500g TCA的瓶中加入227ml蒸馏水,形成的溶液含有100%(M/V)TCA。在室温下保存。
26.1mol/L Tris溶液(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解121。91g Tris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值。对于pH 7.4,加入70ml HCl; 对于pH为7.6加入60ml HCl; 对于8.0的pH,加入42ml HCl。加水稀释至1L,分装后高压灭菌。在室温下保存。
【注意】如1mol/L溶液呈现黄色,应予丢弃并置备质量更好的Tris。
尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值,但仍可向大多数厂商购得合适的电极。Tris溶液的pH值因温度而异,温度每升高1℃,pH值大约降低0。03个单位,应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值。例如:0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8。6.
27.Tris缓冲盐溶液(TBS)(25mmol/l Tris)(1升)
【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0。2g KCl和3g Tris碱,加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4,用蒸馏水稀释至1L,分装后高压灭菌(15 lb in于室温保存。
28.电泳用Tris-乙酸(TAE)(50X)(1升)
【配制方法】称重242g Tris碱,加入800毫升蒸馏水溶解.加入57。1ml冰醋酸和100ml 0.5mol/l EDTA(pH8。0),用蒸馏水补足体积至1升。在室温下保存.
【用法】用蒸馏水稀释1:49。TAE具有相当低的缓冲能力,并且在延伸电泳期间倾向于耗尽.因此,当在高电流下长时间进行电泳时,建议更换缓冲液或两个储存器之间的再循环.
—2
液体循环中20min),
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