农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究

第5期10月

大豆科学SOYBEANSCIENCEVol．33Oct．

No．52014

农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究

1

贾钰莹，蒋

2

滢，赵

111

强，谢甫绨，于翠梅

（1．沈阳农业大学农学院，辽宁沈阳110866；2．沈阳师范大学生化与化学与生命科学学院，辽宁沈阳110034）

摘要：为建立一个大豆子叶节高效遗传转化体系用于大豆基因工程育种，以超高产大豆品种为材料，子叶节为外植

体进行了遗传转化，研究了农杆菌侵染的菌液浓度、侵染时间、共培养基中乙酰丁香酮浓度及共培养时间等影响农杆菌转化的因素。结果表明：适宜转化的侵染和共培养条件为侵染菌液浓度OD600=0．5，侵染时间30min，共培养基含·L-1，有乙酰丁香酮浓度200μmol共培养时间为3～4d。并以此条件对不同基因型超高产大豆品种进行农杆菌转化，结果显示大豆基因型对农杆菌的敏感性存在显著性差异，以沈农9号最敏感，沈农12次之，中黄35最差。关键词：超高产大豆；根癌农杆菌；子叶节；转化

中图分类号：S565．1文献标识码：A9841．2014．05．0634DOI：10．11861/j．issn．1000-

StudyonAgrobacterium-mediatedTransformationSystemofSuper-high-yielding

SoybeanCotyledonNode

JIAYu-ying1，JIANGYing2，ZHAOQiang1，XIEFu-ti1，YUCui-mei1

（1．CollegeofAgronomy，ShenyangAgriculturalUniversity，Shenyang110866，China；2．CollegeofChemistryandLifeScience，ShenyangNormalUniversi-ty，Shenyang110034，China）

Abstract：Toestablishahighfrequencygenetictransformationsystemofsoybeancotyledonnodeforsoybeangeneticengineer-ing，Agrobacteriumconcentration，infectiontime，co-cultivationtimeandacetosyringoneconcentrationofco-culturemediumdur-ingsoybeancotyledonarynodetransformationwerestudiedbyusingsoybeancultivarswithsuper-high-yielding．Theresults

infectiontime30min，co-cultivationtime3-4showedthattheoptimalconditionswereAgrobacteriumconcentrationOD600=0．5，

-1

differentgenotypesofsu-daysandacetosyringoneconcentration200μmol·L．Usingtheoptimizedtransformationprocedure，per-high-yieldingsoybeansweretransformedandthesensitivityofsoybeangenotypestoAgrobacteriumtumefacienswassignifi-cantdifferently．Shennong9wasthemostsensitivematerial，followedbyShennong12，andZhonghuang35wastheleastsensi-tivematerial．

Keywords：Super-high-yieldingsoybeans；Agrobacteriumtumefaciens；Cotyledonarynode；Transformation

大豆（GlycinemaxL．）是重要的油料作物，利用遗传转化技术进行遗传改良的基因工程育种已成

［1］

为当今大豆育种研究的热点。高效遗传转化一直是大豆基因工程领域的难点之一等

［4］

［2-3］

染及共培养阶段的培养条件进行探讨，并在此基础

上比较超高产大豆品种对农杆菌易感性的差异，为超高产大豆应用于基因工程的研究提供参考。

。Hinchee

首次利用农杆菌介导法转化大豆子叶节获得

［5］［6］

转基因植株，之后以子叶、胚性悬浮系、胚等外植体建立了农杆菌转化体

外植体系。其中子叶节再生体系具有再生时间短、容易获得、再生过程简单、再生频率高等优点，已成［9］

为目前较为成熟的大豆农杆菌转化的受体系统。大量研究表明基因型、农杆菌菌株、农杆菌菌液浓度、农杆菌浸染时间、共培养时间及乙酰丁香酮（AS）的浓度等因素都影响农杆菌介导转化大豆子叶节法的转化效率

［10-13］

1

1．1

材料与方法

供试材料

尖

［7］

、愈伤组织

［8］

1．1．1

基因型以在大豆生产实践中创造过超高

产纪录的品种（超高产品种）辽豆14、沈农12、中黄

35及沈农9号为试材，均为丛生芽诱导率在70%以上的适宜再生基因型，由沈阳农业大学大豆研究所提供。

1．1．2菌株与质粒

农杆菌菌株EHA105，由吉林

省农业科学院生物技术中心提供。质粒pCAM-

。

本研究以超高产大豆品种为试材，对农杆菌侵

BIA3301-1图谱见图1，携带bar基因和GUS报告

基因。

12-09收稿日期：2013-004-003-004）。基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2013ZX08004-），mail：jiayuyinggood@163．com。第一作者简介：贾钰莹（1987-女，博士，主要从事大豆遗传转化研究。E-），mail：yucuimei@163．com。通讯作者：于翠梅（1974-女，博士，副教授，主要从事大豆遗传转化与基因工程。E-

5期贾钰莹等：农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究635

图1Fig．1

1图谱质粒pCAMBIA3301-MapofvectorpCAMBIA3301-1

1．21．2．1

方法

外植体准备

1．3

采用氯气灭菌法对大豆种子

26℃培养5d，消毒，然后接种于萌发培养基中，光照

数据分析

采用Excel2003和DPSv7．05进行数据分析。

16h黑暗8h。取萌发培养后的大豆种子，用解剖刀沿种子中线纵向切开，使两片子叶分开，除去顶芽和腋芽，制备子叶节外植体。1．2．2

培养基

萌发培养基：B5基本培养基（pH

-1

2

2．1

结果与分析

遗传转化条件的优化

2．1．1

5．8）；侵染培养基：1/10B5基本培养基+3．9g·L-1BA）+MES+1．7mg·L6-苄氨基腺嘌呤（6-0．25mg·L-1赤霉素（GA3）+400mg·L-1半胱氨酸（Cys）+154．2mg·L-1二硫苏糖醇（DTT）（pH5．4）；BA+L-16-共培养基：1/10B5基本培养基+1．7mg·

0．25mg·L-1GA3+400mg·L-1Cys+154．2mg·L-1DTT+AS（pH5．4）；芽诱导培养基：B5基本培养基·L-16-BA+100mg．L-1头孢0．39g·L-1MES+1．7mg

-1

·L-1青霉素（cef）+250mg．L替卡西林（Tic）+4mg

草铵膦（PPT）（pH5．8）。

农杆菌侵染浓度由图2可知，农杆菌侵染

菌液浓度OD600在0．5时，抗性芽再生率最高，为

75．65%。并且OD600在0．5～0．8时，差异不显著。当农杆菌菌液浓度超过0．8时，抗性芽再生率随着侵染浓度的升高而降低，说明高浓度农杆菌溶液对丛生芽的诱导有抑制作用。因此为便于以后除菌的操作，本着能够达到最大转化效率的最小菌液浓度的原则，本试验选用菌液浓度为OD600=0．5。

1．2．3

从超低温冰箱里保存

的甘油菌中挑取少量菌接种到含有抗生素（50

农杆菌菌液的制备

·mL-1Ｒif）的YEP固体培养基mg·mL-1Kan和25mg

28℃倒置培养2～3d。从单菌落挑菌接种于含上，

50mg·mL-1Kan和25mg·mL-1Ｒif的5mLYEP液28℃，180r·min振荡培养24h。取菌体培养基中，

液1mL到100mLYEP液体培养基中过夜培养，至OD600=0．5～0．6。菌液在5000r·min离心10min收集菌体，然后重悬于用等体积50mL侵染培养基中，备用。

1．2．4大豆子叶节遗传转化

以沈农9号大豆子

叶节外植体，在子叶节区域切3～5刀的伤口，然后放置到培养皿中，试验中设计农杆菌浓度OD600分别

0．3，0．5，0．8，1．0，1．2时侵染大豆子叶节，为0．1，

30，45，60min，用农杆菌分别侵染15，然后用无菌滤

纸吸干菌液，放在共培养基中培养，培养时间为2，3，4，5，6d。AS浓度分别为50，100，200，300，400

·L-1。共培养后转移到芽诱导筛选培养基中培μmol

光照养。每个培养皿中10个子叶节。26℃下培养，16h/8h，20d后，每10d更换1次培养基，统计抗性丛生芽的外植体数，计算抗性芽分化率。抗性芽分化率（%）=抗PPT出芽外植体数/侵染的外植体数×100

-1

-1

图2Fig．2

菌液浓度对大豆抗性丛生芽再生率的影响EffectofAgrobacteriumconcentrationon

regenerationrateofresistantmultipleshoots

2．1．2农杆菌侵染时间由图3可以看出，不同侵染时间的条件下，抗性丛生芽的诱导率呈现显著差异。以侵染30min处理抗性丛生芽诱导率最高，达74．54%，侵染45min次之，为62．39%，侵染60min

图3Fig．3

侵染时间对大豆抗性丛生芽再生率的影响Effectofinfectiontimeonregenerationrateofresistantmultipleshoots

636大豆科学5期

时，抗性丛生芽诱导率最低，为31．31%。因此确定农杆菌侵染时间为30min。

2．1．3共培养基中AS浓度由图4可知，随着乙酰

-1-·L1，·L升高到200μmol丁香酮浓度从50μmol抗性芽

-1·L时，再生率也逐渐升高，在AS浓度达200μmol抗性

为73．58%。但是当AS浓度超过芽再生率达到最高，

200μmol·L-1之后，抗性芽的再生率大大降低，说明添加的AS浓度过高会影响转化效率。

围有农杆菌长出，后期抑菌困难。因此确定共培养时间为3～4d。

图5共培养时间对大豆抗性丛生芽再生率的影响Fig．5Effectofco-culturetimeonregeneration

rateofresistantmultipleshoots

2．2

图4AS浓度对大豆抗性丛生芽再生率的影响Fig．4EffectofASconcentrationonregeneration

rateofresistantmultipleshoots

2．1．4共培养时间图5结果表明，共培养4d，抗性芽再生率最高，达74．07%，与共培养3和5d处理相比差异不显著，但显著高于共培养2及6d的处理。当共培养到第5天和第6天时，在外植体周

不同超高产品种转化效果比较

对4个超高产大豆品种进行农杆菌侵染，侵染

侵染时间为30min，共培养菌液浓度为OD600=0．5，

-1

共培养时间为3～基含有AS浓度为200μmol·L，

4d（图6和表1）。图6为4个品种转化20d的图片，从中可以看出，沈农9品种抗性芽再生效果最好，而中黄35再生效果最差。进一步对再生的抗性芽数量进行统计分析，这4个超高产大豆基因型对农杆菌的易感性存在着显著差异（表1）。沈农9号是最易感的大豆基因型，抗性丛生芽再生率达到了77．64%，其次为沈农12，为64%，易感性最差的品

a．中黄35；b．沈农12；c．沈农9号；d．辽豆14。

a．Zhonghuang35；b．Shennong12；c．Shennong9；d．Liaodou14．

Fig．6Table1

图6不同超高产品种抗性丛生芽再生效果

Ｒegenerationofresistantmultipleshootsfromdifferentsuper-high-yieldingsoybeangenotypes表1超高产大豆对农杆菌的易感性筛选

Screeningofsuper-high-yieldingsoybeangenotypessusceptivetoAgrobacteriumtumefaciens

侵染外植体个数

Explant

抗性丛生芽再生外植体数

No．ofregenerationalresistantmultipleshoots

抗性丛生芽再生率Ｒegenerationrateofresistancemultipleshoots/%

平均Average36．56±2．14c64．00±2．52b77．64±1．38a10．28±0．97d

基因型Genotype

Ⅰ

辽豆14Liaodou14沈农12Shennong12沈农9号Shennong9中黄35Zhonghuang35

100989899

Ⅱ102100102101

Ⅲ99100100102

Ⅰ33687512

Ⅱ37628210

Ⅲ406176．09

Ⅰ33．069．476．512．1

Ⅱ36．362．080．49．9

Ⅲ40．461．076．08．8

5期贾钰莹等：农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究637

种为中黄35，抗性丛生芽再生率仅为10．28%。因此沈农9号为最适合遗传转化的基因型，对农杆菌具有高度的易感性。

3结论与讨论

农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间是建立高效遗传转化体系的重要参数。菌液浓度过低，农杆菌细胞数目过少，不能实现有效的转化；浓度过高，农杆菌细胞间的竞争性抑制反而会降低转化

［9］

效率，同时也对侵染材料有毒害作用。李文霞等以黑农35为试材，菌液浓度选择OD600=0．5时取

［14］

得较好转化效果。周延清等研究表明菌液浓度OD600值在0．60～0．79时，大豆抗性丛生芽诱导率

［15］

最大。李茂福等研究表明，菌液浓度OD600=0．5～0．8时，随着大豆子叶节的芽诱导率最高，OD600升高到1．0时，芽诱导率反而下降，本试验的结果与之相一致。农杆菌侵染时间和共培养时间

DNA向植物细胞转移的机率。时间过直接影响T-T-DNA也不短，农杆菌不能充分附着于外植体上，

能有效地转移，从而降低了转化效率；而时间过长，由于农杆菌过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用，或者造成后期抑菌困难，都会降低转化效率。应珊［16］

适宜的大豆子叶节与农杆菌共培等的研究表明，

养时间为3～5d，抗性芽分化率间差异不显著，但显

［11］

著高于共培养1d。陈李淼等以东农50为试材，

侵染时间以30～40min，获得农杆菌OD600=0．6，共

培养3d取得最好转化效果。以上不同研究结果的差异是由于选用不同基因型外植体，其适宜的侵染和培养条件相应有所不同所致。本试验确定了超高产大豆沈农9号大豆子叶节转化的最佳条件，即菌液浓

共培养时间侵染时间为30min，度OD600=0．5～0．8，

为3～4d。AS可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合，是影响农杆菌介导的大豆转化的重

［17］

要因素。本试验研究结果表明，共培养基中添加

-1

200μmol·LAS可获得最高的抗性芽再生率，这与刘

［18］

圣君等的研究结果相一致。

本研究选择了4个丛生芽诱导率在70%以上的超高产大豆品种进行转化研究，其对农杆菌易感性由易到难的顺序为：沈农9号＞沈农12＞辽豆14＞中黄35。因此超高产大豆沈农9号可作为大豆基因工程育种研究中优先选用的材料。参考文献

［1］HartmanGL，WestED，HermanTK．CropsthatfeedtheWorld

2．Soybean-worldwideproduction，use，andconstraintscausedby

pathogensandpests［J］．FoodSecurity，2011，3：5-17．［2］TrickHN，DinkinsＲD，SantaremEＲ，etal．Ｒecentadvancesin

soybeantransformation［J］．PlantTissueCultureandBiotechnolo-gy，1997，3：9-26．［3］刘海坤，卫志明．大豆遗传转化研究进展［J］．植物生理与分子

2005，31（2）：126-134．（LiuHK，WeiZM．Ｒecent生物学学报，

advancesinsoybeangenetictransformation［J］．PlantPhysiologyandPlantMolecularBiology，2005，31（2）：126-134．）

［4］HincheeMAW，Connor-WardDV，NewellCA，etal．Production

oftransgenicsoybeanplantsusingAgrobacterium-mediatedDNA

transfer［J］．NatureBiotechnology，1988，6：915-922．［5］ParrottWA，WilliamsEG，HildebrandDF，etal．Effectofgeno-typeonsomaticembryogenesisfromimmaturecotyledonsofsoy-bean［J］．PlantCell，TissueandOrganCulture，1989，16：15-21．［6］TrickHN，FinerJJ．Sonication-assistedAgrobacterium-mediated

transformationofsoybean［Glycinemax（L．）Merrill］embryogenicsuspensionculturetissue［J］．PlantCellＲeports，1998，17：482-488．

［7］LiuHK，ChaoY，WeiZM．EfficientAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofsoybeansusinganembryonictipregen-erationsystem［J］．Planta，2004，219：1042-1049．［8］HongHP，ZhangH，OlhoftP，etal．Organogeniccallusasthetar-getforplantregenerationandtransformationviaAgrobacteriumin

soybean（GlycinemaxL．Merr．）［J］．InVitroCellular＆Develop-mentalBiology-Plant，2007（43）：558-568．［9］YamadaT，TakagiK，IshimotoM．Ｒecentadvancesinsoybean

transformationandtheirapplicationtomolecularbreedingandge-nomicanalysis［J］．BreedScience，2012，61：480-494．［10］李文霞，吕文河，等．农杆菌介导大豆子叶节转化系统宁海龙，

J］．中国农业科学，2008，41（4）：971-977．（LiWX，的优化［

NingHL，LyuWH，etal．OptimizationoftheAgrobacterium-medi-atedtransformationsystemsofsoybeancotyledonarynode［J］．Sci-entiaAgriculturaSinica，2008，41（4）：971-977．）［11］陈李淼，单志慧，等．利用农杆菌介导法转化大豆子叶田星星，

．大豆科学，2012，3（1）：17-23．（ChenL节的影响因素研究［J］

M，TianXX，ShanZH，etal．OptimizationofthefactorsaffectinggenetictransformationofsoybeancotyledonarynodemediatedbyAgrobacteriumtumefacines［J］．SoybeanScience，2012，3（1）：17-23．）

［12］DangW，WeiZ．AnoptimizedAgrobacterium-mediatedtransforma-tionforsoybeanforexpressionofbinaryinsectresistancegenes

［J］．PlantScience，2007，173：381-389．［13］LiuSJ，WeiZM，HuangJQ．Theeffectofco-cultivationandselection

parametersonAgrobacterium-mediatedtransformationofChinesesoy-beanvarieties［J］．PlantCellＲeports，2008，27：489-498．

1基因转［14］周延清，李敏，等．根癌农杆菌介导反义fad2-刘艳菊，

2010（9）：17-21．（ZhouY化大豆的研究［J］．河南农业科学，

Q，LiuYJ，LiM，etal．Agrobacteriumtumefaciens-mediatedAnti-sensefad2-1genetransfertocotyledonarynodecellsofsoybean（GlycinemaxL．）［J］．JournalofHenanAgriculturalSciences，2010（9）：17-21．）

［15］李茂福，傅永福，等．农杆菌介导大豆遗传转化的影响因李睿，

J］．山地农业生物学报，2006（4）：283-286．（LiMF，LiＲ，素［

FuYF，etal．InfluencingfactorsontheefficiencyofAgrobacteri-um-mediatedsoybeantransformation［J］．JournalofMountainAgri-cultureandBiology，2006（4）：283-286．）［16］应珊，王秀荣，等．影响农杆菌介导的大豆转化效率的何晓薇，

2008，6（1）：32-40．（YingS，He因素研究［J］．分子植物育种，

XW，WangXＲ，etal．Assessmentoffactorsaffectingthetransfor-mationefficiencyofsoybeancotyledonary-nodeAgrobacterium-me-diatedtransformationsystem［J］．MolecularPlantBreeding，2008，6（1）：32-40．）

［17］XueＲG，ZhangB，XieHF．OverexpressionofaNTＲ1intrans-genicsoybeanconferstolerancetowaterstress［J］．PlantCell，Tis-sueandOrganCulture，2007，89：177-183．［18］刘圣君，卫志明．影响农杆菌介导的大豆子叶节遗传黄健秋，

．分子细胞生物学报，2007，40（5）：286-292．转化的因素［J］

（LiuSJ，HuangJQ，WeiZM．FactorsinfluencingAgrobacterium-mediatedcotyledonary-nodetransformationofsoybean（GlycinemaxL．）［J］．JournalofMolecularCellBiology，2007，40（5）：286-292．）