中华中
医药学刊
Vol．28No．52011年5月CHINESE
ARCHIVESOF
TRADITIONALCHINESE
MEDICINE
May2011
兔异体骨髓间充质干细胞穴位与静脉移植对梗死区CD31及bFGF影响的实验研究
杨永菊1，杨关林2，邱倩2，于长禾2，张哲
1
(1．辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032;2．辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847)
摘要:目的:进行穴位移植与静脉移植两种不同移植途径来观察兔异体骨髓间充质干细胞(MSCs)对梗死
区CD31及bFGF表达的影响的研究。方法:将已建立心肌梗死模型的日本大耳白兔随机分为3组，包括模型对照组、穴位注射干细胞组、静脉注射干细胞组。用开胸结扎冠状动脉前降支的方法建立急性心肌梗死模型，进行
间充质干细胞分离、培养、传代、流式细胞仪检侧兔MSCs表面标志、收集、BrdU标记、Brdu标记率的检测，利用免
疫组化法检测。结果:梗死心肌组织中CD31平均光密度值，与正常组相比较，穴位注射干细胞组均降低，
P＜0．01，静脉注射干细胞组略升高，P＞0．05;与模型对照组比较，穴位注射组P＜0．05，静脉注射组P＜0．01;穴位注
射组与静脉注射组比较，P=0．05。梗死心肌组织中BFGF平均光密度值，与正常组相比较，穴位注射干细胞组升
高，P＜0．05，静脉注射干细胞组降低，P＜0．01;与模型对照组比较，穴位注射组P＜0．05，静脉注射组P＜0．01;
穴位注射组与静脉注射组比较，
P＜0．01。结论:穴位与静脉注射骨髓间充质干细胞显著促进了梗死心肌组织周围内皮细胞的激活、增殖、迁移，显著改善梗死区血液循环。但与穴位组相比较静脉组CD31没有显著差异。穴位注射骨髓间充质干细胞显著促进了梗死心肌组织中表达促毛细血管新生细胞因子bFGF。
关键词:骨髓间充质干细胞;心肌梗死;CD31;bFGF中图分类号:R285．5文献标识码:A文章编号:1673－7717(2011)05－1073－04
ExperimentontheEffectofCD31andbFGFinRegionof
InfarctionbytheInteractionsofAcupointingAllogenicRabbitBoneMarrow
MesenchymalStemCellsandIntravenousTransplantation
YANGYong-ju1，YANGGuan-lin2，QIUQian2，YUChang-he2，ZHANGZhe1
(1．AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTcm，Shenyang110032，Liaoning，China;
2．LiaoningUniversityofTCM，Shenyang110847，Liaoning，China)
Abstract:Objective:Toinvestigatetheaffectofthathowbonemarrowstromalcells(MSCs)workininfractedregion
withCD31，bFGFthroughtwoways，pointinjectionandintravenousinjection．Methods:Modelsofacutemyocardialin-farctiononbig－earedJapaneserabbitsweredividedintothreegroupswhicharemodelcontrolgroup，
pointinjectionstemcellgroupandintravenousinjectionofstemcellgroup．Modelsofacutemyocardialinfarctionwereestablishedbyligating
leftanteriordescendingcoronaryarteryonrabbits．MSCswereisolated，
cultivated，subcultured，testedwithMSCssurface-markerbyFlowCytometer，collected，labeledwithBrdu，testedwithlabelingrateofBrdu，andfinallytestedbyimmuno-histochemicalmethod．Results:Comparedwithnormalgroup，ThemeanODofCD31ininfractedregioninpointinjectionstemcellgroupwerelow(P＜0．01)，intravenousinjectionofstemcellgroupwerehigh(P＞0．05);Comparedwithcon-trolgroup，pointinjectionstemcellgroupwereP＜0．01，intravenousinjectionofstemcellgroupwereP＞0．05;Com-pareintravenousinjectionofstemcellgroupwithpointinjectionstemcellgroup，andtheyweresame(P=0．05);Com-paredwithnormalgroup，themeanODofBFGFininfractedregioninmodelpointinjectionstemcellgroupwashigh(P＜
0．05)，
andintravenousinjectionofstemcellgroupwaslow(P＜0．01);Comparedwithcontrolgroup，pointinjectionstemcellgroupwereP＜0．05，andintravenousinjectionofstemcellgroupwereP＜0．01．Comparedwithpointinjectionstemcellgroup，intravenousinjectionofstemcellgroupwaslow(P＜0．01)．Conclusion:ThereissignificancethatStemcell
injectedintopointsandveinscanactivate，proliferate，
transferandimprovebloodcirculationininfractedregion．Com-paredwithpointinjectionstemcellgroup，
theseisnosignificantdifferenceofCD31inintravenousinjectionofstemcellgroup．ExpressionofangiogenesiscellfactorbFGFisincreasedininfractedregionbypointinjectionwithstemcell．
Keywords:Bonemarrowmesenchymalstemcells;Myocardialinfarction;CD31;bFGF
收稿日期:2010－12－07
基金项目:辽宁省教育厅科技攻关项目(2004D281);辽宁省教育厅创新团队项目(2007T120)作者简介:杨永菊(1982－)，女(满族)，辽宁人，医师，硕士，研究方向:中西医结合治疗心脑血管疾病的临床与科研工作。通讯作者:张哲(1976－)，女，辽宁人，副主任医师，博士，研究方向:中西医结合治疗心脑血管疾病的临床与科研工作。
中
华中医药1073学刊
第29卷第5期
CHINESE
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OF
医药学刊
MEDICINE
Vol．28No．5May2011
2011年5月ARCHIVESTRADITIONALCHINESE
心肌梗死是心血管病中危重的急性事件，近年来的发病有明显的增高趋势，已成为严重威胁人类健康的疾病。目前急性心肌梗死的治疗手段主要有药物溶栓治疗、介入治疗、心脏搭桥和心脏移植、基因治疗等，虽能一定程度上恢复再灌注，挽救濒死的心肌，但不能重建新生的血管并替代病损的心肌。促进梗死区的血运重建和循环改善是心肌细胞再生的前提和基础。心肌细胞能否再生或心梗后尚存活的心肌细胞能否长期存活并发挥泵血功能，主要取决于心梗后的心肌能否获得充分的血供。研究发现人体各种组
——干细胞，织器官的原始细胞—具有多向分化潜能，能分化
为心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等，可代替病损的
［1－2］
。而骨髓间充质干细胞心肌细胞并重建新生血管
(mesenchymalstemcell，MSCs)是一种多潜能分化干细胞，
［3］
能分化成心肌细胞，并且由于其取材方便，免疫源性弱、无伦理问题、分离培养方法较简单、增殖较快等优点，使它成为目前细胞移植较理想的靶细胞。
国内外MSCs移植途径主要包括:外周静脉注射、冠状动脉注射、心内膜心肌注射、心外膜心肌注射和穴位注射等。其中经外周静脉注射干细胞方法简单，并且使治疗广
“叠泛性心肌病成为可能。而穴位注射利用了穴效药效即
，加效应”在小剂量、短时间的情况下，产生大剂量静脉注
射等强度或者更强的药效。CD31为血小板内皮细胞黏附因子－1(plateletendothelialcelladhesionmolecule－1PE-CAM－1)，主要表达于内皮细胞，是现在最常用的血管内皮细胞标记之一。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，为成纤维生长因子家族中的一员，它在血管形成和组织再生过程中起着十分重要的作用。本研究旨在探讨穴位移植与静脉移植两种不同移植途径来观察兔异体骨髓间充质干细胞(MSCs)对梗死区CD31及bFGF表达的影响。1材料和方法1．1设计
随机对照动物实验。1．2时间及地点
于2007年6－8月在辽宁中医药大学针灸电生理实验室完成。1．3材料
1．3．1实验动物的选择日本大耳白兔55只(购自辽宁
2～3个月龄，中医药大学实验动物中心)，体重2～3kg，雌
实验过雄不限。动物质量合格证号:scxk(辽)2004－0018，
《关于善待实验动物程中对动物的处置符合2006年科技部
［4］
的指导性意见》的规定。
1．3．2主要试剂与仪器见表1。1．4实验方法
表1主要试剂与仪器
中华中医药1074学刊
试剂与仪器
来源
间充质干细胞培养基及、间充质干细胞
Ficoll－paqueplus、培、养基添加物、
加拿大Stemcell公司
PBS、PBS不含体积分数为0．2的FBS、含FBS、胰酶－EDTACD34－FITC抗体、CD29－FITC抗体BrdU、Ⅰ型和Ⅲ型胶原单克隆抗体、培养瓶
CKX41倒置显微镜
FACSCalibur流式细胞仪
武汉博士德公司美国COSTAR公司OLYMPUS美国BD
1．4．1骨髓间充质干细胞的获得取健康日本大耳白兔2只，经胫骨平台抽取骨髓，进行间充质干细胞分离、培养、
BrdU标记、传代、流式细胞仪检侧兔MSCs表面标志、收集、
Brdu标记率的检测。
1．4．2急性心肌梗死模型建立①麻醉:乌拉坦腹腔注
V1、V5导联心电图;③备皮;④射;②术前心电图:采集Ⅱ、
开胸;⑤结扎:于左心耳下约2mm处结扎左室支;⑥术后心电图:以心电图胸前两个导联出现ST段抬高为成功标志，表明左室支完全结扎;⑦关闭胸腔;⑧抽血:术后24h耳动脉采血夹心酶联免疫法测定肌酸磷酸激酶同工酶增高。1．4．3实验动物分组与干预因素将造模成功的日本大耳白兔30只，随机分为3组:①模型对照组:单纯造模，不予任何干预。②穴位注射干细胞组:急性心肌梗死造模成功后1周，取心俞(双侧)至阳、膻中4穴，局部消毒，回抽
6
无血，予干细胞混悬液1×l0细胞/穴穴位注射。③静脉注射干细胞组:急性心肌梗死造模成功后1周，将兔耳缘静
6
脉，局部消毒，回抽无血，予干细胞混悬液2×l0细胞/静脉注射。干预后第5周，麻醉动物，于活体下迅速取出心脏。并于30s内迅速切下梗死及梗死周围区心肌组织，用40g/L多聚甲醛固定。以10只未造模兔为正常对照组。
1．4．4主要观察指标免疫组织化学染色:将蜡块做5μm厚连续切片，按SABC免疫组化试剂盒步骤操作。主要观察CD31及bEGF的表达。利用MetamorphOfline图像分析系统，每张切片随机选择5个高倍视野(40×)，测量CD31、bEGF免疫组化染色的平均集成吸光度值。1．4．5设计、实施、评估者实验设计、干预实施及结果评估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。1．4．6统计学分析数据以珋x±s表示，多个样本均数间的比
P＜0．05为有统计学意义。全部数据较采用单因素方差分析，
均输入Excel工作表中，用SPSS15．0统计软件分析处理。2结果
2．1实验动物数量分析
实验兔55只，正常组10只，余45只造模，根据预实验得出的造模成功率70%计算，最后造模成功30只，随机分为3组，至实验结束模型对照组存活7只，穴位注射干细胞组存活8只，穴位注射干细胞组存活7只。2．2兔MSCs干细胞的分离、培养、体外扩增、鉴定及标记2．2．1培养在分离培养48h后通过全量换液除去各种类型悬浮生长的血细胞，贴壁生长的原代MSCs数量少，散在存在，呈长梭形，细胞两极端有细丝(图1)，经过3～4天
5～7天后出现较大的静止期后细胞增殖能力加强(图2)，
细胞灶(集落形成)，每个约有20～100个形态均一的梭形细胞，呈单个分散存在(图3)，至8～10天细胞集落扩大，呈较均一的长梭形或三角形(图4)，以集落方式增殖，密集排列，呈螺旋梳状。
2．2．2体外扩增达80%融合时消化传代，每瓶单层融
6
合的MSCs消化后平均获得(2．2±0．39)×10个MSCs，将
1周左右达到融合，这些细胞再传代培养，可继续传代扩
增，细胞在非刺激条件下反复传代，一些呈圆形贴壁细胞仍然存在但数目小于5%，传代细胞生长旺盛时呈旋涡样。2．2．3流式细胞仪鉴定结果流式细胞仪检测细胞表面
CD29阳性。细胞均一性较好，抗原CD34阴性，提示MSCs
为区别于造血干细胞的骨髓非造血类细胞(见图5～6)。2．2．4Brdu标记率的检测结果传代培养的骨髓间充质
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干细胞经体外brdu标记后，细胞免疫化学法检测检测射组P＜0．05，静脉注射组P＜0．01;穴位注射组与静脉注
(DAB染色×400)细胞核呈棕褐色(图7)。显微镜下随机射组比较，
P=0．05。选取10个高倍视野计数阳性和阴性细胞数，求得Brdu体外标记率可达80%～85%。
图1骨髓在分离培养48h后通过全量换液除去各种类型悬浮生
长的血细胞，贴壁生长的原代骨髓间充质干细胞(MSCs)数量少，图5流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34阴性
散在存在，呈长梭形，细胞两极端有细丝(400×)
图2骨髓分离培养3～4天静止期后细胞增殖能力加强，通过全量换液除去各种类型悬浮生长的血细胞(400×)
图6
流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29阳性
图3骨髓在分离培养5～7天后出现较大的细胞灶(集落形成)，每个约有20～100个形态均一的梭形细胞，呈单个分散存在(400×)
图7传代培养的骨髓间充质干细胞经体外brdu标记后，细胞核
呈棕褐色。DAB染色×400
2．3．2免疫组化法检测梗死心肌组织中BFGF结果免疫组化法检测梗死心肌组织中BFGF平均光密度值，与正
常组相比较，穴位注射干细胞组升高，P＜0．05，静脉注射
干细胞组降低，P＜0．01;与模型对照组比较，穴位注射组P
＜0．05，静脉注射组P＜0．01;穴位注射组与静脉注射组比较，
P＜0．01。表2免疫组化法检测梗死心肌组织中
CD31和BFGF检测结果
图4培养至8～10天细胞集落扩大，形态呈较均一的长梭形或三组别CD31BFGF角形，以集落方式增殖，密集排列，呈螺旋梳状(400×)
2．3免疫组化法检测梗死心肌组织中CD31及BFGF检测正常组(10)22．63±11．90▲▲△△23．92±19．41▲△模型组(7)11．28±7．59＊＊△27．62±14．08＊△结果
穴位注射干细胞组(8)16．29±11．49＊＊▲31．59±19．04＊▲2．3．1免疫组化法检测梗死心肌组织中CD31结果免静脉注射干细胞组(7)23．27±12．35＊＊＊△△△▲▲
20．42±13．25＊＊△△▲▲
疫组化法检测梗死心肌组织中CD31平均光密度值，与正
注:括号中数字为观察的兔子数;与正常对照组比较，*P＜0．05，＊＊P＜0．01，*常组相比较，穴位注射干细胞组均降低，P＜0．01，静脉注
＊＊P≥0．05;与模型组比较，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01，▲▲▲P≥0．05;与穴位注射干射干细胞组略升高，P＞0．05;与模型对照组比较，穴位注
细胞组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01，△△△P≥0．05。中
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银杏叶提取物抗四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的实验研究
122
黄强，方承康，黄国栋
(1．浙江中医药大学附属温州中医院，浙江温州325000;2．南昌大学第一附属医院，江西南昌330006)要:目的:探讨银杏叶提取物(GBE)抑制NF－kappaBp65的表达在四氧化碳(CCl4)诱导Wistar大鼠肝
纤维化中肝细胞损伤的意义。方法:采用CCL4诱导的大鼠肝纤维化模型。生化检测各组血清丙氨酸氨基转移酶
摘
(ALT)、天氨酸氨基转移酶(AST)。采用免疫组化S－P方法检测肝细胞NF－kappaBp65和ICAM－1表达并分析与肝细胞损害的关系。结果:治疗组大鼠的血清肝功能指标和肝纤维化病理分级与模型组比较都有显著的改善(P＜0．05);治疗组大鼠肝组织细胞因子水平与模型组比较也显著降低(P＜0．05)结论:银杏叶提取物可减轻肝组织的损伤及其纤维化程度，通过抑制NF－kappaBp65的表达，进一步减弱了ICAM－1的表达，可能是其抗肝纤维化作用的靶点之一。
关键词:肝纤维化;银杏叶提取物;NF－kappaBp65;ICAM－1中图分类号:R285．5文献标识码:A文章编号:1673－7717(2011)05－1076－03
AnExperimentalStudyonEffectsofGinkgoBilobaExtractAgainst
onRatsHepaticFibrosisinducedbyCCl4
HUANGQiang1，FANGCheng-kang2，HUANGGuo-dong2
(1．TheWenzhouHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity，Wenzhou325000，Zhejiang，China;
2．TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，Jiangxi，China)
Abstract:Objective:ToresearchtheeffectsandmechanismofGinkgobilobaextract(GBE)onratswithhepaticfi-3
分析与讨论
急性心肌梗死发生后，促进梗死区的血运重建和循环改善是减少心梗面积的主要方法。干细胞治疗为促进梗死区血运重建、血管新生带来了光明的前景。CD31为血小板内皮细胞黏附因子－1(plateletendothelialcellad－hesionmolecule－1PECAM－1)是140KD的细胞表面单链糖蛋白，主要表达于内皮细胞，是现在最常用的血管内皮细胞标记之一。与CD31单克隆抗体结合的内皮细胞较远时，属于新生的内皮细胞。此研究显示，穴位注射骨髓间充质干细胞与静脉注射骨髓间充质干细胞组显著上调了梗死心肌组织中CD31表达，提示穴位与静脉注射骨髓间充质干细胞显著促进了梗死心肌组织周围内皮细胞的激活、增殖、迁移，显著改善梗死区血液循环。但穴位组相比较静脉组CD31没有显著差异。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，为成纤维生长因子家族中的一员，是一分子量为16KD的单链多肽，其PH值为9．6。在心血管系统中，血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有合成bFGF的能力。大量的研究已发现bFGF通过促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，阻抑平滑肌细胞游走促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。具有促进细胞增殖与分化，促进血管新生，改善侧枝循环，减少心肌坏死，治疗心肌梗死的作用。本研究显示穴位注射骨
收稿日期:2010－12－17
基金项目:江西省卫生厅中医药科研资助项目(2002A57)作者简介:黄强(1984－)，男，江西上饶人，硕士研究生，研究方向:
肝病的临床及科研。
髓间充质干细胞显著上调了梗死心肌组织中bFGF表达，而静脉注射骨髓间充质干细胞组bFGF表达下调，提示穴位注射骨髓间充质干细胞显著促进了梗死心肌组织中表达促毛细血管新生细胞因子bFGF。
穴位注射干细胞组与静脉注射干细胞组的bFGF表达相比较时，虽然穴位注射干细胞组明显高于静脉注射干细胞组而没有表现出CD31显著差异，可能是因为调控血管
bFGF只是其新生的生长因子是一个复杂的网络调解系统，
中的一个调解因子，或者是因为移植时间和剂量的差异，在相关因子升高的时候我们没有采集，但应结合实验的心功能改善、心梗面积缩小、改善细胞凋亡等整体结果(未在本文中讨论)来考虑。这一结果提示穴位注射干细胞组中的干细胞一方面可能有利于bFGF基因的稳定有效表达，另一方面又有利于bFGF浓度的精准维持和生理性负反馈调节，因此能更好地调控CD31程度，以促进梗死区的血运重
有效降低心肌梗死病死率。建和循环改善，
参考文献
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generatedfrommarrowstromalcellsinvitro［J］．JClinInvest，1999，103(5):697－705．
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［4］中华人民共和国科学技术部．关于善待实验动物的指导性意
S］．2006－09－30．见［
中
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