烟草生物技术研究进展

文章编号：１００９－０００２（２００７）０６－１０７１－０４

生物技术通讯

１０７１

综述

烟草生物技术研究进展

金磊，周冀衡，杨虹琦

湖南农业大学烟草工程技术研究中心，湖南长沙４１０１２８［摘要］

烟草作为高等植物生物技术研究的模式植物，在生物技术的发展中发挥了重要作用。随着生物技术的发展，烟草

抗虫、抗逆性及品质改自身的研究也取得了显著进展。简要综述了烟草现代生物技术的研究进展，尤其是基因工程在抗病、良、生物反应器等方面的研究策略和动态。［关键词］

转基因；烟草；生物技术

［中图分类号］

Ｑ９４３．２/Ｑ７８９［文献标识码］Ａ

ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＴｏｂａｃｃｏＲｅｓｅａｒｃｈｅｓ

ＪＩＮＬｅｉ，ＺＨＯＵＪｉ－ｈｅｎｇ，ＹＡＮＧＨｏｎｇ－ｑｉ

ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＴｏｂａｃｃｏＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］

Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｔｏｂａｃｃｏ，ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ/ｔｏｂａｃｃｏ/ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｉｅｓａｎｄｄｙｎａｍｉｃｏｆｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｎ

ｄｉｓｅａｓｅｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｉｎｓｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｈａｒｄｉｎｅｓｓ，ｑｕａｌｉｔｙｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅａｃｔｏｒｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．

现代生物技术以分子生物学、细胞生物学、生物化学、微生物学等新成就为先导，是涉及多学科的综合性科学技术体系。植株再生、原生质体培养、花粉培养和基因转化等许多新技术都是在烟草上首先获得成功的，继而在其他作物上推广形成完善的技术体系。同时，以烟草自身为对象的研究也取得了显著进展，并在抗病、抗虫、抗逆性及品质改良等方面展示了良好的前景，可望从根本上解决目前存在的诸多问题，为市场提供更优质、更安全的烟草产品，也为烟草产业寻求更为广阔的发展空间。

棉中克隆了ＲＡＲ１和ＳＧＴ１基因，转基因烟草离体叶片对赤星病的抗性显著提高。窦道龙等［３］首次将ＮＤＲ１基因导入烟草，转基因植株对赤星病和晚疫病的抗性都明显提高。

ＤｅＷｉｔ等根据Ｆｌｏｒ的基因对基因学说，提出了获得具非专

化抗性的转基因抗病植物的“双组分系统理论”，即在某一特定的寄主－病原菌互作系统中，把病原菌的无毒基因（Ａｖｒ）和寄主的抗病基因（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ，Ｒｇｅｎｅ）与一个特殊启动子融合在一起，组成双组分系统导入寄主植物中。当受到侵染时，两者的产物互作后诱发ＨＲ，从而使植物抗病。该策略目前受到Ｒ基因来源的限制，但Ａｖｒ基因不但能诱发寄主植物也可诱发某些非寄主植物产生ＨＲ，这一现象表明在不相关的植物中可能含有一些结构相似功能相同的Ｒ基因，这些基因能被非病原菌的Ａｖｒ基因识别。由于很多Ａｖｒ基因已被克隆，因此可利用这一特性更广泛地应用Ａｖｒ基因介导植物的广谱抗病性。刘国胜等［４］将从丁香假单胞杆菌番茄菌系（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）克隆得到的ＡｖｒＤ，分别与病原特异诱导表达的启动子ＰＡＬ、ＣＨＳ构建表达载体转入烟草，结果证明对赤星病的侵染和扩展起了明显的阻遏作用。

１抗病性研究

根据基因的抗病机理大概可分为两类，一类是激发植物诱

导抗性基因，它本身没有毒性，但能诱发植物的防卫反应，对病原菌没有严格的种属专一性，又被称为广谱抗病基因工程［１］；另一类是目的基因产物对病原菌有直接毒性或参与毒性物质的积次生代谢中的关键酶类，以及来源不累过程，如病程相关蛋白、同的抗菌肽。

１．１诱导植物系统性获得抗性

植物受坏死型病原侵染后，在未侵染部位产生对随后病原

１．２１．２．１

毒性或毒性相关途径病程相关蛋白

植物在病理或病理相关环境下，会产生

物侵染的抗性，称为系统获得抗性（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，

ＳＡＲ）。诱发ＳＡＲ的病原物包括诱导侵染组织产生过敏性反应

（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＲ）的非亲和性病原，及诱导产生坏死斑的亲和性病原。ＨＲ导致侵染部位周围细胞迅速死亡，诱导植物产生ＳＡＲ，从而提高未侵染部位的广谱抗病能力。

植物受病源物侵染后，若植物抗病蛋白（Ｒ）能识别病原无毒基因（ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅ，Ａｖｒｇｅｎｅ），就会激发活性氧暴发，产生活性氧中间物及ＨＲ。目前已经鉴定了ＮＤＲ１、ＲＡＲ１及ＳＴＧ１等几李为民等［２］从海岛个Ｒ蛋白下游参与植物防卫反应的信号元件。

大量的病程相关蛋白（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＲ）。ＰＲ可由细菌、病毒、植物激素、某多种因素诱导产生，如植物病原真菌、

些化学药物等。迄今纯化到的ＰＲ中，大多数具有几丁质酶和β－

１，３－葡聚糖酶活性

［收稿日期］

［基金项目］［作者简介］［通讯作者］

［５］

，尤其是ＰＲ中含有病毒复制抑制因子

２００７－０３－１２

云南省烟草公司科技基金资助项目（０６Ａ０４）金磊（１９８４－），男，硕士研究生

周冀衡，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｊｈｚｈｏｕ２００５＠１６３．ｃｏｍ

１０７２

（ＩＶＦ）的发现［６］，再次证明了ＰＲ与植物诱导抗病性的密切关系。

张凤丽［７］的研究表明，Ｎ基诱导烟草ＰＲ需要Ｎ基因的支持。

因在开启状态下，ＰＲ大量合成；Ｎ基因关闭，ＰＲ不再合成。烟草

ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２００７

于αＡＩ对哺乳动物的淀粉消化酶具有抑制作用，应用前景不如蛋白酶抑制剂乐观。

生物技术通讯

２．４植物外源凝集素基因

植物外源凝集素（ｌｅｃｔｉｎ）是一类具有至少１个能识别并可逆

Ｎ基因是已发现的抗烟草花叶病毒（ＴＭＶ）基因中最有效的，可抗

绝大多数ＴＭＶ组成员。这是一个单显性基因，很容易进入育种程序，目前已经得到了有效抗ＴＭＶ的转Ｎ基因烟草植株［８］。

自１９８３年Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ等首次报道烟草转基因以来，烟草抗病基因工程已经取得了一定的成就［９－１２］。应用转基因技术转入ＰＲ基因，可以解决Ｎ基因缺乏产生的不便。Ｂｒｏｇｌｉｅ［１０］和Ｙｏｓｈｉｋａｗａ［１１］等分别把克隆的Ⅰ类几丁质酶基因和来自大豆的β－１，３－葡聚糖酶酶基因导入烟草，提高了烟草对根腐病菌、赤星病菌和黑胫病菌侵染的抗性。蓝海燕等［１３］同时将烟草碱性β－１，３－葡聚糖酶和菜豆碱性几丁质酶基因转化入烤烟Ｋ３２６，经活体接菌试验，与对照植株相比，转基因植株对赤星病有较强的抵抗能力。时焦等［１４］以烤烟ＣＦ８０、Ｋ３２６和香料烟Ｘａｎｔｈｉ－ｎｃ为供试材料，也获得了高抗赤星病的转基因植株。

结合α－Ｄ－甘露糖残基的植物蛋白，它能特异结合到昆虫肠道的糖缀合物上，影响营养物质的吸收，并可促进消化道内细菌的繁殖，导致昆虫死亡。其中雪花莲外源凝集素（Ｇａｌａｎｔｈｕｓｎｉｖａｌｉｓ

ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＧＮＡ）在体外或转基因植物的抗虫试验中，已证实对

某些咀嚼式和刺吸式昆虫如蚜虫、烟草夜蛾和叶蝉有抗性。周岩等

［１９］

将编码ＧＮＡ成熟蛋白的ＧＮＡ１２基因及其前体蛋白基因

ＧＮＡ３４整合入烟草，转基因植株能抑制蚜口密度４５％～６０％。受ＧＮＡ蛋白表达量多少的影响，不同试验对蚜虫的抑制程度也有

差异，柴红梅等［２０］报道的结果为２５％～９０％。

２．５昆虫特异性神经毒素

昆虫特异性神经毒素是一类对昆虫神经系统有毒杀作用的

蜘蛛等分泌的毒液纯化而来。毛立群蛋白类神经毒素，由蝎子、

等［２１］对来自虱状蒲螨（Ｐｙｅｍｏｔｅｓｔｒｉｔｉｃｉ）的昆虫特异性神经毒素基因ｔｏｘ３４进行了序列改造，将改造后的基因导入烟草，再生植株叶片的棉铃虫饲喂实验显示对低龄幼虫有很好的毒杀作用。

从抗虫基因工程的发展前景看，单个抗虫基因的使用难以得到满意的抗虫效果，昆虫较易产生抗性。因此，筛选具有不同杀虫机制的多种抗虫蛋白十分必要，组合不同杀虫基因产生的混合蛋白的杀虫活性大于单个抗虫蛋白之和。将Ｂｔ蛋白基因和

１．２．２溶菌酶溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）是在生物中普遍存在的酶类，

它对细胞中的肽聚糖具有特殊的水解活性。许多生物的溶菌酶具有几丁质酶和溶菌酶活性的双重功能，既能降解真菌细胞壁中的几丁质和葡聚糖，又对植物病原细菌表现出很强的裂解活性。王冰山等［１５］将人体溶菌酶基因导入烟草，离体叶对野火病的抗病性有了较大提高。

１．２．３天蚕素天蚕素（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）由３０多个氨基酸残基组成，它

作用于细菌的细胞膜，破坏膜的完整性，造成离子通道，最终导致细胞内含物泄露。目前一种稳定的蚕素类似物ＭＢ３９已经在烤烟中得到表达，转基因植株的后代被野火病侵染后不会产生坏死症状［１６］。

ＯＣ基因共转化烟草的试验表明［２２］，转双基因植株具有显著杀虫

活性，３龄棉铃虫的死亡率为４６．７％～８０．０％。赵存友等［２３］将Ｂｔ蛋白基因与ＧＮＡ基因转入烟草，６０％的受试转化烟草上的棉铃虫

５ｄ内死亡率达到１００％。范贤林等［２４］的试验结果表明，棉铃虫幼

虫取食转双基因（Ｂｔ蛋白基因与ＣｐＴＩ基因）烟草３ｄ后死亡率为８０．５％～９９．３％，取食６ｄ后死亡率达１００％，均显著高于对照烟草（转单基因）。

２

２．１

抗虫性研究

苏云金杆菌毒蛋白基因

苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）是一种革兰阳性土壤

３抗逆性研究

干旱和盐碱对烟草构成渗透胁迫，是影响烟草产量和质量

细菌，在孢子形成时产生杀虫晶体蛋白（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏ－

ｔｅｉｎ，ＩＣＰ）。ＩＣＰ与昆虫的中肠上皮细胞的刷边状膜反应，并与特

细胞溶解，进殊受体结合，打开阳离子选择通道，从而引起肿胀、

而导致死亡。Ｂｔ毒蛋白存在的问题是其抗虫谱有限，且昆虫可能通过改变肠道中的ｐＨ值以降低ＩＣＰ的溶解度和蛋白酶水解活性，以达到减少活性ＩＣＰ的浓度和抗ＩＣＰ的目的。

的重要因素。抗逆性状一般受多基因控制，而且与低劣品质性状连锁，仅通过常规育种方式难以获得优良的抗性品种。

由于对植物渗透调节的分子机制尚缺乏足够的认识，抗旱、抗盐碱的植物基因工程仍在摸索阶段，主要途径是将脯氨酸、甜菜碱和糖类等小分子渗透调节剂合成途径中的关键酶基因导入烟草中，提高其表达量，以达到抗性的目的。Ｋｉｓｈｏｒ等［２５］将△１－吡咯啉－５－羧基合成酶（脯氨酸生物合成最后一步的关键酶）Ｐ５ｃｓ基因导人烟草，在干旱胁迫下，转基因烟草落叶少且迟，根比对照长４０％，生物量比对照增加２倍。甜菜碱是一种重要的调渗调节剂，但在烟草中并不能积累。Ｒａｔｈｉｎａｓａｂａｐａｔｈｉ等［２６］和梁峥等［２７］分别将大肠杆菌和菠菜中的ＢＡＤＨ基因转入烟草，其甜菜碱的积累水平与植株的抗胁迫能力成正比。

晚期胚胎发生丰富蛋白（ｌａｔｅ－ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ－ａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏ－

２．２蛋白酶抑制剂基因

蛋白酶抑制剂（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＩ）能与昆虫消化道内蛋

白酶结合形成酶－抑制剂复合物，干扰昆虫的正常消化过程。ＰＩ和消化酶结合还会刺激消化腺的过量分泌，使昆虫产生厌食反应，最终导致昆虫非正常发育或死亡。其抗虫谱较广，而且作用于昆虫消化酶的活性中心，可以排除昆虫通过突变产生抗性的可能。目前已有多种ＰＩ基因被克隆，其转基因植株表现出良好的抗虫效果，如豇豆蛋白酶抑制剂（ｃｏｗｐｅａｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＣｐＴＩ）基水稻巯基蛋白酶（ｏｒｙｚａｃｙｓｔａｔｉｎ，ＯＣ）基因［１８］等。目前存在的问因［１７］、

题是如何提高ＰＩ基因的表达水平，以获得理想的抗虫效果。

ｔｅｉｎｓ，ＬＥＡ蛋白）是一类保护生物大分子及膜结构的蛋白质，使

植物能够在水分亏缺时保护细胞膜系统及生物大分子免受破坏。极端干旱的情况下，被诱导出的ＬＥＡ蛋白对植物所起的保护作用显得更为突出［２８］。Ｉｍａｉ等［２９］对烟草转诱导脱落酸（ＡＢＡ）的葡

２．３淀粉酶抑制剂基因

淀粉酶抑制剂（α－ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，αＡＩ）与蛋白酶抑制剂类

似，它抑制昆虫消化道内的α－淀粉酶，阻断其主要能量来源。由

金磊等：烟草生物技术研究进展

糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因的研究表明，在水分亏缺条件下，在没有组织特异性的营养器官和有组织特异性的再生组织中，ＬＥＡ蛋白基因ＤＮＡ５＇端能调控ＧＵＳ基因的表达，诱导ＡＢＡ大量产生，从而增强植株的抗旱性。

水通道蛋白（ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ，ＡＱＰ）是维持渗透平衡的一类重要蛋白质，存在于所有生物体中，促进水分借助一种渗透梯度跨膜转运。烟草中也含有定位在细胞质膜上的质膜水通道蛋白ＰＩＰ１。

１０７３

多改造后的基因串起来转入烟草，再修饰编码出的小肽，最后得到高产量的五肽神经肽。其他药物如抑制ＨＩＶ复制的天花粉蛋白［３７］、调节红细胞水平的促红细胞生长素［３８］和人组织型纤酶溶原激活剂［３９］等近年来均有报道。

５．２为人类提供新的食品来源

许多植物储存器官含有的蛋白中缺少一些必需氨基酸，如

豆类蛋白中缺乏含硫氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸，而谷类蛋白中缺乏赖氨酸和色氨酸等。Ａｌｅｍｂｉｃ等构建了一个巴西豆２Ｓ清蛋白的种子特异表达载体，转基因烟草的种子中２Ｓ清蛋白含量占总蛋白的８％，蛋氨酸的含量提高３０％之多。

Ｂｉｅｌａ等［３０］在烟草根上发现了对汞不敏感的水通道蛋白。对ＡＱＰ

表达调控的研究表明，在发育控制中，水通道蛋白可在转录水平、翻译水平及蛋白亚细胞的分布上受到调控。Ｏｐｐｅｒｍａｎ等［３１］报道，烟草根水通道蛋白ＴｏｂＲＢ７启动子含有２个直接与根系表达相关的顺式作用元件，在正常发育条件下或在线虫感染而形成根系结接时，均可表达。

周涵韬等［３２］从红树植物白骨壤（Ａｖｉｃｅｎｎｉａ）中分离到了耐盐基因ＣＳＲＧ１，转化植株在盐分提高到２％ＮａＣｌ和全海水（盐度为２４）配置的ＭＳ培养基中，成活率保持在８０％～９０％。这种耐盐性不仅针对钠离子胁迫，而且对于各种离子的综合盐胁迫都具有耐受性。另有报道指出［３３］，将肌醇甲基转移酶（ｉｎｏｓｉｔｏｌｍｅｔｈｙｌ－

５．３其他用途

聚３－羟基丁酸酯（ＰＨＢ）的物理化学特性与传统塑料相似，

而且具有生物降解性，如取代化学合成塑料，将能从源头解决塑料废弃物引起的白色污染，但目前已实现的微生物发酵法小规模生产ＰＨＢ因价格过高难以推广使用。苏景昱等

［４０］

构建了含

ｐｈｂＢ、ｐｈｂＡ、ｐｈｂＣ和ａａｄＡ基因表达盒的叶绿体整合及表达载

体，转基因烟草中目的基因转录水平表达量高、环境安全性好、底物丰富、产物区域化，在转基因生产ＰＨＢ方面极具潜力。

ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｉｍｔｌ）基因转入烟草，所获得的转化植株也表现出明显

的耐盐能力。

６展望

结合我国烟草生产的实际情况，应该在如下几个方面开展

４品质改良

香味是优质烟叶的重要指标之一，许多关键性的致香成分

烟草生物技术的研究工作。第一，继续加强基础研究工作。由于可供利用的基因数量非常有限，因而转基因育种工作只是针对很少几种病虫害而开展的。应加强基因筛选工作，为培育优质、多抗的烟草品种奠定基础。第二，加强转基因品种的安全性评估和检测工作。目前有关转基因烟草的安全性评估方面的工作很少，今后有必要对安全性评估的技术与方法进行研究，从而为优质抗病转基因烟草品种的推广应用提供科学依据。

如大马酮、氧化异佛尔酮、紫罗兰酮等都与类胡萝卜素的代谢过程密切相关，所以提高类胡萝卜素的含量是增加烟草香气的有效途径之一。有关酶基因表达调控机制的研究已取得一些有意义的结果，据报道［３４］，转ＰＳＹ基因烟草可使β－胡萝卜素含量提高

１０８％。但也有人认为［３５］，虽然转基因烟草中类胡萝卜素含量有所

提高，但对香气量影响不大。

类萜代谢是烟草的重要次生代谢途径之一，类萜合成起始于异戊二烯（ＩＰＰ），法呢基焦磷酸合成酶是异戊二烯途径中的一个关键酶。崔红等［３６］首次将外源法呢基焦磷酸合成酶基因转入烟草，为探讨利用类萜次生代谢改良烟叶品质奠定了基础。

甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径长期以来被认为是所有生物ＩＰＰ合成的惟一途径，但近年发现植物质体内还存在ＤＸＰＳ途径，脱氧木酮糖－５－磷酸合成酶（ＤＸＰＳ）和脱氧木酮糖－５－磷酸还原异构酶（ＤＸＲ）是这一途径中的２个关键酶。ＤＸＰＳ、ＤＸＲ在烟草中的过双萜、四萜化合物及其衍生物的量表达，将在总体上增加单萜、

含量，这些与烟叶香气品质密切相关的香气物质或前体物质的过量积累，无疑会增加烟叶香气量，改善烟叶香气品质。目前，

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５

５．１

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ｍｕｌａｔｉｏｎｊｅｖｅｌｏｆｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｔｈｒｏｕｇｈｐｒｏ－ｔｅｉｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｏｔａｎｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００３，４５（９）：１０８４

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析［Ｊ］．农业生物技术学报，２０００，８（１）：５３

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ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｐｒｏｌｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｆｅｒｓｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９５，

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